同種異基因骨髓移植后α-GalCer的應(yīng)用加速免疫重建并未加重aGVHD.pdf

1、目的：造血干細胞移植后免疫重建及急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-host disease，aGVHD)的研究為本領(lǐng)域研究的熱點。NKT細胞是T淋巴細胞中的一新型的調(diào)節(jié)型細胞，α-GalCer(α-galactosylceramide，α-半乳糖神經(jīng)酰胺)，能特異性識別并激活NKT細胞，迅速的大量的分泌IFN-γ及IL-4。本研究在小鼠同種異基因骨髓移植模型中探討移植后受鼠體內(nèi)α-GalCer的應(yīng)用是否有促進免疫重

2、建的作用，同時不加重aGVHD，并對其機制進行初步的探討。
　　 方法：1.建立同種異基因清髓性骨髓移植模型。C57BL/6小鼠為供鼠，BALB/c小鼠為受鼠。首先摸索出最小的清髓性輻射劑量，之后以此輻射劑量作為骨髓移植前的預(yù)處理，建立兩個aGVHD嚴重程度不同的骨髓移植模型。2.利用aGVHD相對較輕的骨髓移植模型，實驗組骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer，對照組骨髓移植后立即腹腔注射溶劑DMSO。移植后同一時間點檢測兩組

3、小鼠脾臟的單個核細胞計數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、B220+、CD40+、CD86+、CD11c+、CD80+細胞的相對數(shù)目；供者細胞嵌合率；胸腺的單個核細胞計數(shù)和細胞組份；造血重建。并進行體外造血干細胞集落的培養(yǎng)及體內(nèi)、外T、B細胞的增殖實驗。3.利用aGVHD嚴重程度不同的兩個骨髓移植模型，實驗組骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer，對照組骨髓移植后立即腹腔注射溶劑DMSO。在每個移植模型中觀察兩組小鼠的生存期、aGVHD的

4、臨床表現(xiàn)和病理改變、供者細胞嵌合率。并進行移植后6小時血清及移植后d27脾臟單個核細胞培養(yǎng)上清細胞因子的檢測；體內(nèi)、外胸腺、脾臟、外周血、外周淋巴結(jié)單個核細胞及T細胞的遷移檢測。
　　 結(jié)果：1.≥7.5Gy TBI為清髓劑量。以7.5Gy TBI為預(yù)處理，在輸注相同的骨髓細胞數(shù)的前提下，輸注脾細胞數(shù)3×107及1×107，建立兩個aGVHD嚴重程度不同的同種異基因骨髓移植模型。2.在輸注脾細胞數(shù)1×107骨髓移植模型中，骨髓移

5、植后d70，實驗組小鼠脾臟單個核細胞計數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、B220+、CD40+及CD86+細胞的比例均明顯高于對照組，CD11c+、CD80+細胞的比例兩組間無區(qū)別；胸腺單個核細胞計數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+細胞的比例兩組間無區(qū)別，且均較正常小鼠明顯偏低。移植后早期d7，實驗組供者細胞嵌合率高于對照組。移植后d3，實驗組外周血白細胞高于對照組。體外造血干細胞集落培養(yǎng)，α-GalCer組較DMSO組CFU數(shù)目明顯多。

6、體內(nèi)、外T、B細胞增殖實驗，α—GalCer組較DMSO組T、B細胞明顯增殖。3.在aGVHD嚴重程度不同的兩個骨髓移植模型中，實驗組小鼠較對照組小鼠生存時間明顯延長，aGVHD臨床表現(xiàn)及病理改變減輕。4.在輸注脾細胞數(shù)1×107移植模型中，移植后6小時血清中IL-4水平實驗組小鼠與腹腔注射α-GalCer的正常小鼠、腹腔注射α-GalCer的單純照射小鼠無差異，均明顯高于腹腔注射DMSO的單純照射小鼠；血清中IFN-γ水平實驗組小鼠與

7、腹腔注射α-GalCer的單純照射小鼠無差異，稍高于腹腔注射DMSO的單純照射小鼠，均明顯低于腹腔注射α-GalCer的正常小鼠。移植后d27脾臟單個核細胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-10水平實驗組高于對照組，而IFN-γ、IL-2水平實驗組低于對照組。5.體內(nèi)、外遷移實驗：在α-GalCer的作用下單個核細胞、CD3+、CD4+、CD8+細胞從胸腺、脾臟、外周血中出來，遷移至外周淋巴結(jié)。
　　 結(jié)論：1.BALB/c小鼠接受60

8、Coγ射線TBI的致死劑量是≥7.5Gy。在接受7.5Gy TBI的預(yù)處理后，輸注相同的骨髓細胞數(shù)的前提下，輸注不同的脾細胞數(shù)建立兩個aGVHD嚴重程度不同的骨髓移植模型，隨著輸注脾細胞數(shù)增加，aGVHD的嚴重程度隨之增加。2.移植后α-GalCer的應(yīng)用促進T細胞、B細胞的免疫重建，同時增加第二刺激信號CD86、CD40的表達。3.α-GalCer加速的免疫重建與α-GalCer促進供者細胞的早期植入、促進造血干細胞的增殖與分化、促進