阻抑蛋白多糖合成對(duì)涎腺腺樣囊性癌生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的: 涎腺腺樣囊性癌(SACC)是最常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤之一，本課題以人涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移株ACC-M細(xì)胞為研究模型，采用RNAi技術(shù)沉默人XT-I基因，阻抑ACC-M細(xì)胞中PG的生物合成，觀察PG分泌減少對(duì)ACC-M細(xì)胞生長(zhǎng)及生物學(xué)特性的影響，探討PG在SACC發(fā)生發(fā)展中的意義，為今后應(yīng)用RNAi技術(shù)治療涎腺腫瘤提供新思路。 方法: 1、制備及鑒定抗人木糖基轉(zhuǎn)移酶(XT-I)蛋白多克隆抗體分析選擇人XT-I蛋白的優(yōu)

2、勢(shì)抗原表位，PCR擴(kuò)增相應(yīng)區(qū)域DNA片段，插入表達(dá)載體pGEX-4T-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，獲得融合表達(dá)產(chǎn)物。將純化的可溶性蛋白GST-XT作為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備抗XT-I蛋白的多克隆抗體，間接ELISA法測(cè)定效價(jià)。GST柱親和層析法純化抗體，Western blot法鑒定該抗體的特異性和生物學(xué)活性。 2、構(gòu)建靶向抑制人XT-I基因的shRNA真核表達(dá)載體根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)短鏈寡核苷酸，化學(xué)合成雙鏈D

3、NA片段，克隆到pGenesil-1載體中，構(gòu)建靶向人XT-I基因的shRNA真核表達(dá)載體shRiAWJ3和shRNAWJ4，同時(shí)設(shè)計(jì)合成一條不針對(duì)人類任何基因的陰性對(duì)照質(zhì)粒；構(gòu)建的質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切及核酸測(cè)序鑒定。 3、XT-I基因沉默效果的測(cè)定及穩(wěn)定阻抑PG合成的細(xì)胞株的建立將shRNA真核表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染ACC-M細(xì)胞，觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)并計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染效率。濃度為500μg/ml的G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)s

4、hRNA的細(xì)胞株：ACC-M-WJ3、ACC-M-WJ4和陰性對(duì)照ACC-M-HK；采用Real-Time PCR和Western blot檢測(cè)RNAi后細(xì)胞XT-I的表達(dá)；生物染色法檢測(cè)細(xì)胞合成分泌PG的變化。 4、阻抑PG的合成分泌對(duì)ACC-M細(xì)胞增殖的影響選擇三組細(xì)胞：ACC-M-WJ3細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)、ACC-M細(xì)胞(空白對(duì)照組)和ACC-M-HK細(xì)胞(陰性對(duì)照組)進(jìn)行細(xì)胞增殖特性的檢測(cè)。 采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定(細(xì)

5、胞計(jì)數(shù)法、MTT法)、克隆形成試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，觀察阻抑PG的合成與分泌對(duì)ACC-M細(xì)胞體外增殖的影響。 裸鼠皮下移植瘤試驗(yàn)：15只4周齡雌性BALB/C-nu裸鼠，體重16-17g，隨機(jī)分為三組，分別注射ACC-M-WJ3細(xì)胞、ACC-M細(xì)胞和ACC-M-HK細(xì)胞于裸鼠左前背部皮下，每只裸鼠注射細(xì)胞2×106個(gè)/0.2ml。觀察各組移植瘤增殖情況，于接種后第28天處死裸鼠，測(cè)量比較各組移植瘤瘤體體積、稱量

6、瘤重，計(jì)算抑瘤率。移植瘤組織常規(guī)固定、包埋，制作病理切片，HE染色觀察組織學(xué)變化。 5、阻抑PG合成分泌對(duì)ACC-M細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移特性的影響選擇三組細(xì)胞：ACC-M-WJ4、ACC-M(空白對(duì)照組)和ACC-M-HK(陰性對(duì)照)進(jìn)行細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移特性的研究。 粘附試驗(yàn)：將各組細(xì)胞以1×104/100μl/孔分別接種于包被BSA和Matrigel的96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)1h后，MTT法檢測(cè)其490nm吸光值，計(jì)算粘附率。

7、 劃痕試驗(yàn)：將三組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿形成細(xì)胞單層。用10μl移液器tip頭劃痕單層培養(yǎng)細(xì)胞，照相記錄初始劃痕區(qū)相對(duì)距離。PBS清洗兩次，更換含10g/L BSA和1％FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后換成10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，于培養(yǎng)后12h，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各組越過(guò)劃痕邊緣向空白處運(yùn)動(dòng)生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)及劃痕愈合時(shí)間。 侵襲實(shí)驗(yàn)：將Millicell小室內(nèi)加入2×104/200μl個(gè)細(xì)胞，小室內(nèi)加入含10

8、g/L BSA和1％FBS DMEM的培養(yǎng)液；小室外加入400μl條件培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24h后，取出Millicell小室，甲醇固定15min，HE染色，計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算侵襲抑制率。 裸鼠試驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：選擇20只4周齡雌性BALB/C-nu裸鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射ACC-M-WJ4細(xì)胞、ACC-M-HK細(xì)胞和ACC-M細(xì)胞及生理鹽水。注射量為0.2ml，其中含細(xì)胞4×106/只，每組5只。6周后處死裸鼠，稱量裸

9、鼠體重、新鮮肺重量，并觀察裸鼠肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。肺標(biāo)本常規(guī)固定、石蠟包埋，制備4μm組織切片，HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 全部數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異有顯著性,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、制備及鑒定抗人XT-I蛋白多克隆抗體確定XT-I的N端氨基酸序列(175-205)為抗原表位，構(gòu)建了重組表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白GST-XT，并以

10、其為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備了抗XT-I蛋白的多克隆抗體。間接ELISA法證實(shí)其效價(jià)高；Western blot結(jié)果顯示：該抗體特異性良好。 2、構(gòu)建靶向抑制人XT-I基因的shRNA真核表達(dá)載體針對(duì)XT-I基因的mRNA序列設(shè)計(jì)構(gòu)建了2個(gè)特異性shRNA真核表達(dá)載體，分別命名為：shRNA-WJ3和shRNA-WJ4；陰性對(duì)照質(zhì)粒命名為: shRNA-HK。經(jīng)酶切及核酸測(cè)序鑒定證實(shí)：shRNA-WJ3和shRNA-

11、WJ4、shRNA-HK均符合設(shè)計(jì)要求。 3、shRNA真核表達(dá)載體對(duì)XT-I基因沉默效果的測(cè)定并建立穩(wěn)定阻抑PG合成的細(xì)胞株ACC-M細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-WJ3和shRNA-WJ4后可穩(wěn)定表達(dá)GFP，轉(zhuǎn)染效率較高。經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA載體的細(xì)胞株，分別命名為：ACC-M-WJ3、ACC-M-WJ4和ACC-M-HK。Real-Time PCR和Western blot結(jié)果顯示：shRNA-WJ3和shRNA-W

12、J4對(duì)XT-I的mRNA抑制率分別為83.70％、86.81％；對(duì)XT-I的蛋白表達(dá)抑制率分別為79.60％和80.10％。ACC-M-WJ3和ACC-M-WJ4細(xì)胞每24h分泌的PG(GAGs)抑制率為49.70％-66.06％。 4、沉默XT-I基因阻抑PG的合成分泌對(duì)ACC-M細(xì)胞增殖的影響倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染后的ACC-M細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡；ACC-M-WJ3細(xì)胞胞漿固縮，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞核變小、染色質(zhì)固縮、邊集

13、、消失。對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)改變。 細(xì)胞計(jì)數(shù)與MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)：ACC-M-WJ3細(xì)胞的增殖受到抑制，增殖速度明顯低于空白對(duì)照ACC-M細(xì)胞和陰性對(duì)照ACC-M-HK細(xì)胞。 ACC-M-WJ3細(xì)胞克隆形成率為：18.93±5.43％，與ACC-M細(xì)胞(37.40±2.86％)和ACC-M-HK細(xì)胞(32.87±5.70％)相比，明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)；克隆形成抑制率為49.39％。 流式細(xì)胞術(shù)檢

14、測(cè)各組細(xì)胞周期顯示：ACC-M-WJ3細(xì)胞與ACC-M細(xì)胞和ACC-M-HK細(xì)胞相比：S期細(xì)胞數(shù)目減少；G1/G0期細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05)。三組細(xì)胞的G2/M％期細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。ACC-M-WJ3細(xì)胞、ACC-M細(xì)胞和ACC-M-HK細(xì)胞的PI指數(shù)分別為：25.1、60.63、52.63，差異有顯著性(P<0.01)。 ACC-M-WJ3組細(xì)胞凋亡率為28.44±3.45％，分別與ACC-M細(xì)胞(3.2

15、1±1.50)％和ACC-M-HK細(xì)胞(7.34±1.50)％相比，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論: 1、本研究中制備的抗人XT-I蛋白多克隆抗體，效價(jià)高、特異性好，可用于檢測(cè)人細(xì)胞中XT-I蛋白的檢測(cè)。 2、靶向XT-I基因的shRNA真核表達(dá)載體shRNA-WJ3和shRNA-WJ4特異性沉默效率高，XT-I的mRNA抑制率為83.70％、86.81％；XT-I的蛋白抑制率分別為79.60％和80.10

16、％。 3、高效抑制XT-I基因可以顯著降低ACC-M細(xì)胞合成分泌PG的水平，ACC-M-WJ3和ACC-M-WJ4細(xì)胞每24h的PG抑制率為49.70％-66.06％。 4、阻抑PG合成分泌的ACC-M細(xì)胞增殖受到明顯抑制，克隆形成抑制率為49.39％。細(xì)胞周期發(fā)生改變：S期細(xì)胞數(shù)目減少；G1/G0期細(xì)胞數(shù)目增加；細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，凋亡率為28.44±3.45％。 5、裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示：阻抑PG合成的ACC-M

17、-WJ3細(xì)胞組皮下移植瘤增殖明顯被抑制，瘤重抑瘤率為42.39％。 6、阻抑PG合成與分泌后ACC-M細(xì)胞體外粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力顯著降低：粘附抑制率為42.36％，侵襲抑制率為54.14％。 7、阻抑PG合成與分泌后ACC-M細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力明顯降低，轉(zhuǎn)移率僅為40％。 綜上所述：本課題采用RNAi技術(shù)，沉默ACC-M細(xì)胞中人XT-I基因，有效地抑制了細(xì)胞PG合成與分泌。阻抑PG合成與分泌后ACC-M細(xì)胞的增殖、