一種新海洋化合物Tree神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制初步探討.pdf

1、從南海海洋真菌Paecilomyces sp.Treel-7的發(fā)酵菌體中提取分離得到的一種新的海洋化合物Tree,化學(xué)名為(3R,4S,4aS)-74-((3R,4aS)-4a-(甲酯基)-2,3,4,4a-四氫-4,8,9-三羥基-3-甲基-1-氧-1H-氧雜蒽-7-)-2,3,4,4a-四氫-4,8,9-三羥基-3-甲基-1-氧-1H-氧雜蒽-4a-羧酸,化學(xué)結(jié)構(gòu)與黑麥酮酸(Secalonic acid A)近似。有關(guān)Secalon

2、ic acid A的研究僅見于Kurobane等(1987)報(bào)道的對小鼠白血病腫瘤細(xì)胞L1210具有細(xì)胞毒活性的抗腫瘤研究,而對細(xì)胞保護(hù)作用的研究未見報(bào)道。我們前期的初步研究篩選出Tree具有細(xì)胞保護(hù)作用,本論文目的主要是進(jìn)一步證實(shí)海洋化合物Tree對多種神經(jīng)元的保護(hù)作用及對其可能的保護(hù)機(jī)制作初步的探討。
　　 一、Tree對神經(jīng)元的保護(hù)作用1.Tree對秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用本文通過Hoechst33258

3、核染色、LDH相對釋放量及流式細(xì)胞儀等多種凋亡檢測手段初步探討了Tree對秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡模型的保護(hù)作用。Hoechst33258核染色結(jié)果顯示Tree可濃度依賴性地降低秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡,1,3和10μM的Tree可將神經(jīng)元的凋亡率從秋水仙堿組的56.0±2.34％分別降低到51.4±1.4％,37.6±2.4％和13.3±0.4％,與秋水仙堿模型組比較3,10μM濃度的Tree組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

4、01)。而經(jīng)1μM,3μM,10μM Tree預(yù)處理后LDL相對釋放量從秋水仙堿模型組的166.2±7.2％分別降低為137.4±34.9％,85.3±7.0％和90.6±19.9％,與秋水仙堿模型組比較,3,10μMTree處理組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示了1μM秋水仙堿處理大腦皮層神經(jīng)元24h后細(xì)胞的存活率由正常狀態(tài)時(shí)的94.8±0.15％降為73.7±0.57％,而經(jīng)不同濃度Tree處理

5、后可以提升細(xì)胞的存活率,0.1μM,1μM,3μM和10μM Tree組的存活率分別為78.7±0.64％,84.5±0.35％,90.4±0.54％和92.8±0.53％。與秋水仙堿模型組比較,1,3和10μM Tree組的細(xì)胞存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tree對秋水仙堿誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡具有一定的保護(hù)作用,這種保護(hù)作用在Tree的濃度為10μM時(shí)最顯著。
　　 2.T

6、ree對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用為了深入研究Tree對神經(jīng)元的保護(hù)作用,我們又在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型上利用Hoechst33258核染色和LDH相對釋放量檢測Tree對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用。Hoechst33258核染色結(jié)果顯示Tree在濃度為0.001,0.01,0.1μM時(shí)的神經(jīng)元凋亡率分別為52.0±5.4％,35.1±3.3％和29.7±5.6％。與5mM KCl組相比,Tree在0.

7、01和0.1μM能降低低鉀引起的凋亡率升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中0.1μM的Tree能最為明顯降低神經(jīng)元凋亡率,可使凋亡率從低鉀組的62.0±4.3％降為29.7±5.6％,差異具有顯著性(P<0.01)。LDH相對釋放量的結(jié)果顯示經(jīng)低鉀處理后的LDH相對釋放量升高到167.9±21.1％,而Tree在濃度為0.001,0.01,0.1μM時(shí)的LDH相對釋放量分別為154.7±15.4％,120.3±13.4％和117.5±10.4％。與

8、5mM KCl組相比,Tree在0.01和0.1μM能降低低鉀引起的LDH相對釋放量的增加,差異具有顯著性(P<0.01)。
　　 以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tree對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡具有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用在Tree的濃度為0.1μM時(shí)最顯著。
　　 3.Tree對體內(nèi)外多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用在1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元死亡的PD細(xì)胞模型上0.01、0.1、1μM的

9、Tree組可濃度依賴性提升MPP+降低的TH陽性神經(jīng)元的數(shù)目,從MPP+組的57.34±13.6％分別提升至72.5±10.3％,86.0±2.2％,106.5±2.6％,其中0.1、1μM的Tree組與MPP+組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)能夠引起小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失,紋狀體內(nèi)DA含量下降,我們用MPTP30mg/kg每日腹腔注射一次,連續(xù)給藥五

10、天的方法建立PD小鼠模型。利用酪氨酸羥化酶(TH)ABC染色法統(tǒng)計(jì)黑質(zhì)內(nèi)殘存神經(jīng)元的數(shù)目,高效液相測量紋狀體多巴胺含量。結(jié)果顯示:連續(xù)注射MPTP可使中腦黑質(zhì)內(nèi)TH陽性多巴胺能神經(jīng)元減少,為對照組的52.3±3.6％:紋狀體內(nèi)多巴胺含量顯著降低,由正常的6.62±1.33ng/mg下降到2.46±0.48ng/mg,與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。而0.03,0.15,0.75mg/kg的Tree預(yù)處理組能劑量依賴地提升MP

11、TP降低的多巴胺神經(jīng)元數(shù)目,從MPTP組的52.3±3.6％分別提升到70.2±3.5％,88.2±2.0％,87.3±4.6％,各組與MPTP組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。其中0.15、0.75mg/kg的Tree還可顯著提升紋狀體多巴胺含量到3.99±0.39和4.15±0.46ng/mg,與MPTP組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MPP+能明顯引起細(xì)胞死亡,Tree可拮抗MPP+的細(xì)

12、胞毒性,顯示Tree具有多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用。而Tree可減少由MPTP導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)元的丟失,增加紋狀體內(nèi)的多巴胺含量。提示Tree對PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中的多巴胺能神經(jīng)元有很好的保護(hù)性干預(yù)作用。
　　 二、Tree保護(hù)神經(jīng)元機(jī)制的初步探討1.Tree和尼莫地平能拮抗秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元中JNK和p38的激活在秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡模型上,利用Western blot方法檢測到MAPK通路中的JNK和

13、p38兩種激酶被激活,在秋水仙堿處理6h時(shí)磷酸化水平升高至峰值。當(dāng)給以不同濃度的Tree預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)Tree可以濃度依賴性的降低JNK和p38的磷酸化。L-型鈣離子通道拮抗劑尼莫地平同樣也可濃度依賴性抑制JNK和p38的磷酸化,并能降低神經(jīng)元的凋亡率。
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tree可以濃度依賴性的降低JNK和p38的磷酸化。尼莫地平可拮抗秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡時(shí)JNK和p38的激活。
　　 2.Tree能拮抗

14、秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元中caspase-3的激活秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡時(shí)caspase-3被激活,在16h時(shí)蛋白表達(dá)水平升高至峰值。而經(jīng)不同濃度的Tree預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)Tree可以濃度依賴性的降低caspase-3的表達(dá)。上述結(jié)果提示Tree可能是通過拮抗caspase-3的激活從而發(fā)揮保護(hù)大腦皮層神經(jīng)元作用的。
　　 3.Tree具有拮抗秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元內(nèi)鈣濃度升高作用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示秋水仙堿可顯著

15、升高大鼠大腦皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度[ca2+]i,6h時(shí)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度達(dá)到最高。100μM尼莫地平能明顯降低秋水仙堿誘導(dǎo)的鈣離子濃度升高。經(jīng)不同濃度Tree預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)Tree可濃度依賴性減少皮層神經(jīng)元內(nèi)鈣濃度,這種作用在10μM濃度時(shí)最顯著。
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示秋水仙堿誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡過程中伴隨有鈣離子內(nèi)流,L.型鈣離子拮抗劑尼莫地平可以拮抗鈣離子內(nèi)流。Tree對大腦皮層的保護(hù)作用很可能跟拮抗秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神

16、經(jīng)元內(nèi)鈣濃度升高有關(guān)。提示Tree可能與尼莫地平抑制凋亡機(jī)制相似。
　　 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)Tree具有神經(jīng)元保護(hù)作用,不僅對秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡模型和低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型有良好的神經(jīng)元保護(hù)作用,而且對MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞學(xué)模型和MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠動(dòng)物模型也具有保護(hù)性干預(yù)作用。鈣離子參與了秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元的凋亡,應(yīng)用海洋化合物Tree可抑制JNK和p38的磷酸化,也能抑制easpa

17、se-3的表達(dá),另外Tree能拮抗大腦皮層鈣離子內(nèi)流。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:海洋化合物Tree可能成為新一代對神經(jīng)退行性疾病具有潛在神經(jīng)元保護(hù)作用的藥物,并為研究和開發(fā)新一代抗神經(jīng)退行性疾病藥物提供了理論基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論
　　 1.Tree對秋水仙堿誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元凋亡、MPTP/MPP+誘導(dǎo)的PD動(dòng)物或細(xì)胞模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡,以及低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡有保護(hù)性干預(yù)作用；
　　 2.JNK和p3