枸櫞酸鉀干預(yù)下腎結(jié)石大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白的表達(dá).pdf

1、腎結(jié)石是泌尿外科常見病、多發(fā)病,發(fā)病率高,且隨著生活水平的提高,其發(fā)病率呈上升趨勢.因此腎結(jié)石的發(fā)生機(jī)制和防治研究一直是泌尿外科醫(yī)師關(guān)注的問題. 近年來國際上的研究發(fā)現(xiàn)Tamm-Horsfall蛋白(Tamm-Horsfall protein,THP)可能是一種抑制尿路結(jié)石形成的大分子有機(jī)物.但是THP抑制結(jié)石形成的機(jī)制及其所起的作用,不同的研究得到不同的結(jié)果,存在較大爭議.雖然國外有研究者報(bào)道了腎結(jié)石大鼠腎臟組織THP表達(dá)的結(jié)

2、果,但還沒有治療因素干預(yù)下腎結(jié)石大鼠腎臟組織THP表達(dá)的研究報(bào)道. 枸櫞酸是研究最早最充分的結(jié)石抑制因子之一,但其確切的防石機(jī)制,與其他大分子抑制因子之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究.因此,我們研究枸櫞酸鉀干預(yù)下腎結(jié)石大鼠腎組織THP的表達(dá),了解枸櫞酸鉀干預(yù)對腎組織THP表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討枸櫞酸鉀抑制結(jié)石形成的機(jī)制,及枸櫞酸鉀與THP之間的相互關(guān)系,這不僅為解析腎結(jié)石發(fā)病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),對臨床尋求腎結(jié)石的防治途徑也具有一定的指

3、導(dǎo)意義. 方法: 1、動(dòng)物和組織準(zhǔn)備:選擇20只雄性SD大鼠(由浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供),體重約350g左右,以含有0.5﹪乙二醇和0.5﹪氯化銨的混合溶液為致石劑.先將大鼠正常條件下飼養(yǎng)一周,使其充分適應(yīng)環(huán)境后,隨機(jī)分成3組:對照組4只:喂普通凈化飲用水;結(jié)石組8只,以致石劑代替飲用水;枸櫞酸鉀干預(yù)組8只,除以致石劑代替飲用水外,同時(shí)用25﹪枸櫞酸鉀溶液以1ml/100g體重每天灌胃一次.為使三組大鼠實(shí)驗(yàn)

4、條件保持一致,結(jié)石組和對照組用凈化水以1ml/100g體重每天灌胃一次.兩周后處死大鼠,解剖取腎臟,肉眼下觀察腎臟表面形態(tài),再沿腎門長軸剖開,部分腎組織用10﹪甲醛固定,部分組織于解剖顯微鏡下觀察腎剖面結(jié)石形成情況. 2、結(jié)石形成觀察:先肉眼觀察腎臟表面形態(tài),再將剖開的腎臟置于解剖顯微鏡下,觀察腎剖面結(jié)晶結(jié)石的形成.以腎臟剖面有無明顯結(jié)晶沉淀物、游離結(jié)石作為判斷有無結(jié)石的標(biāo)準(zhǔn).并根據(jù)結(jié)晶結(jié)石形成的量及腎臟損傷的程度分為四級(jí),進(jìn)行

5、統(tǒng)計(jì)分析. 3、腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度測定:采用免疫組織化學(xué)法測定腎臟組織THP的相對表達(dá)量,使用SANTA CRUz公司兔抗人Tamm-Horsfall蛋白291-425序列氨基酸多克隆抗體及羊抗兔ABC染色系統(tǒng)試劑盒.先將甲醛固定的腎臟組織脫水浸蠟包埋,3um厚切片,再脫蠟水化后,1﹪H<,2>O<,2>-PBS溶液封閉內(nèi)生過氧化物酶,1.5﹪的血清阻斷1小時(shí),THP-抗(濃度:2ug/ml)或PBS陰性對照室溫下孵育30分鐘

6、,生物素化羊抗兔二抗中孵育30分鐘,卵白素和生物素化辣根過氧化物酶孵育30分鐘,DAB顯色5分鐘,再蘇木素復(fù)染,乙醇二甲苯脫水透明,中性樹脂封片.最后于光學(xué)顯微鏡下觀察,按"+++"表示明顯染色(深棕黃色),"++"表示中度染色(黃色),"+"表示輕度染色(淺黃色),進(jìn)行分級(jí)并統(tǒng)計(jì)分析. 4、數(shù)據(jù)處理:通過SPSSl3.0 for windows專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件,采用Kruskal-Walls非參數(shù)檢驗(yàn)對三組大鼠腎臟成石程度和THP

7、表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)對三組大鼠腎臟成石程度和THP表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行兩兩比較. 結(jié)果: 1、腎臟結(jié)石的形成:肉眼觀察三組腎臟表面大體形態(tài),對照組大鼠腎臟外形無明顯異常,質(zhì)地軟,未見鈣化斑形成;結(jié)石組大鼠腎臟明顯腫脹,質(zhì)地變硬,腎表面可見大量淺黃色鈣化斑,部分鈣化斑融合;枸櫞酸鉀干預(yù)組大鼠腎臟稍腫脹,表面亦可見淺黃色鈣化斑,但融合不明顯.解剖顯微鏡下觀察,對照組大鼠.腎剖面均無可見的結(jié)晶結(jié)

8、石沉淀物;結(jié)石組大鼠腎剖面嵌有大量的結(jié)晶,并可見游離結(jié)石形成;枸櫞酸干預(yù)組大鼠腎剖面可見少量結(jié)晶沉淀,未見游離結(jié)石形成.對三組大鼠成石程度進(jìn)行分級(jí),采用Kruskal-Walls非參數(shù)檢驗(yàn)對三組大鼠腎臟成石程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,三組之間成石程度存在顯著差異(P<0.01),采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)對三組大鼠腎臟成石程度進(jìn)行兩兩比較,發(fā)現(xiàn)對照組與結(jié)石組之間、對照組與枸櫞酸鉀干預(yù)組之間及結(jié)石組與枸櫞酸鉀干預(yù)組之間成石程度均有顯著

9、差異. 2、腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度:三組大鼠腎臟組織的THP免疫組化染色均顯示THP主要定位于腎小管亨氏襻和遠(yuǎn)曲小管,但是在相同稀釋度的一抗和相同的實(shí)驗(yàn)條件下,三組大鼠腎臟組織內(nèi)THP表達(dá)的強(qiáng)度差別很大.對照組THP染色很深,而結(jié)石組染色很淺,枸櫞酸鉀干預(yù)組則介于兩者之間.按照上述標(biāo)準(zhǔn)對三組進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì),采用Kruskal-Walls非參數(shù)檢驗(yàn)對三組大鼠腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)三組間JTHP表達(dá)強(qiáng)度存在顯著差異(P<0.

10、01),采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)對三組大鼠腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行兩兩比較,發(fā)現(xiàn)對照組與結(jié)石組之間、對照組與枸櫞酸鉀干預(yù)組之間及結(jié)石組與枸櫞酸鉀干預(yù)組之間腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度均有顯著差異. 3、腎臟成石程度與腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系:將每只大鼠腎臟成石程度與腎組織THP表達(dá)強(qiáng)度相對應(yīng),發(fā)現(xiàn)在結(jié)石形成強(qiáng)度為"+++"的結(jié)石組大鼠腎組織中THP表達(dá)明顯減弱,多為"+";而對照組大鼠及一只成石程度為"+"的枸櫞酸鉀干預(yù)