枸櫞酸鉀對(duì)三聚氰胺氰尿酸鹽腎結(jié)石大鼠的干預(yù)研究.pdf

1、研究背景
　　 2007年3月美國(guó)大量動(dòng)物因食用含有三聚氰胺與三聚氰酸的寵物飼料發(fā)生急性腎衰竭而死亡。這些中毒寵物均出現(xiàn)尿毒癥癥狀,并伴有血尿、食欲減退、嘔吐、昏睡等多種癥狀。在死亡寵物的在腎臟組織內(nèi)遠(yuǎn)曲小管或者集合管內(nèi)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的特異性結(jié)晶。這些結(jié)晶經(jīng)紅外光譜證實(shí)為三聚氰胺-三聚氰酸混合物。Puschner等對(duì)貓進(jìn)行了三聚氰胺及其同系物的毒性研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)喂含有三聚氰胺的飼料持續(xù)10天,在貓的腎功能上沒(méi)有觀察到明顯的變化,在腎臟內(nèi)

2、也沒(méi)有見(jiàn)到腎內(nèi)晶體形成。而以三聚氰胺和三聚氰酸的飼料喂貓,貓出現(xiàn)急性腎功能衰竭,在貓的尿液和腎組織切片中可以觀察到暗黃色的晶體形成。Reimschuessel等用三聚氰胺和三聚氰酸各400mg/kg來(lái)灌胃4種不同的魚(yú),在魚(yú)的組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)三聚氰胺及三聚氰酸二者的殘余。梁毅文等的研究也證實(shí)了單獨(dú)利用三聚氰胺(30mg/kg-400mg/kg)或者三聚氰酸(30mg/kg-400mg/kg)單獨(dú)灌胃大鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)腎臟功能有影響,而利用三聚氰胺與

3、三聚氰酸聯(lián)合灌胃SD大鼠,不管是三聚氰胺和三聚氰酸各30mg/kg還是各400mg/kg均可以在大鼠尿液或者腎臟內(nèi)觀察到特異性的結(jié)晶形成,并經(jīng)紅外光譜證實(shí)該結(jié)晶為三聚氰胺氰尿酸鹽,該晶體可對(duì)腎臟造成損害,在400mg/kg大劑量時(shí)一周內(nèi)觀察到大鼠因急性腎衰竭死亡。Takahiro Kobayashi等的研究也證實(shí)了聯(lián)合灌胃三聚氰胺與三聚氰酸(12—120mg/kg)可致大鼠腎結(jié)石,在腎臟內(nèi)同樣可以觀察到結(jié)晶的形成。
　　 據(jù)中國(guó)

4、衛(wèi)生部的報(bào)道,截止到2008年11月,294000名嬰幼兒因食用含有三聚氰胺的問(wèn)題奶粉而發(fā)生泌尿系統(tǒng)疾病,其中50000多名兒童住院,更為嚴(yán)重的是其中6名兒童因急性腎衰竭而死亡。在這些受影響的嬰幼兒中,很多發(fā)生泌尿系結(jié)石。對(duì)于三聚氰胺問(wèn)題奶粉兒童的結(jié)石成分分析顯示,梁軍對(duì)5例問(wèn)題奶粉術(shù)后結(jié)石成分分析為二水尿酸和尿酸胺。南京大學(xué)孫西釗對(duì)南京地區(qū)問(wèn)題奶粉患兒結(jié)石成分分析也得到相同的成分。北京兒童醫(yī)院對(duì)問(wèn)題奶粉患兒結(jié)石成分分析表明了含有三聚氰

5、胺和尿酸。Grases F等報(bào)道了一例兒童由于食用含有三聚氰胺的奶粉引起膀胱結(jié)石,通過(guò)結(jié)石成分顯示為三聚氰胺和尿酸的混合物。三聚氰胺可以在尿液中形成結(jié)晶當(dāng)它的濃度超過(guò)最低限量。三聚氰胺因?yàn)槠浜枯^高(66.67％)而被不法商人摻入到食品中來(lái)虛假提高其蛋白含量。在中國(guó)的一些問(wèn)題奶粉中,也可以檢查到含有三聚氰胺及三聚氰酸。而且,在其他食品中,比如餅干、液態(tài)奶、奶糖、巧克力等制品中也發(fā)現(xiàn)含有不同濃度的三聚氰胺及三聚氰酸。三聚氰胺是工業(yè)上廣泛

6、應(yīng)用的工業(yè)產(chǎn)品,主要用來(lái)制造三聚氰胺甲醛樹(shù)脂,也可以用來(lái)生產(chǎn)涂料、塑料、粘合劑、廚房臺(tái)面、餐具等。三聚氰酸也廣泛用來(lái)自來(lái)水、游泳池的消毒。
　　 中國(guó)衛(wèi)生部專門(mén)針對(duì)嬰幼兒三聚氰胺泌尿系結(jié)石的治療而發(fā)表了《與食用受污染三鹿牌嬰幼兒配方奶粉相關(guān)的嬰幼兒泌尿系統(tǒng)結(jié)石診療方案》。其中堿化尿液是治療的方法之一。枸櫞酸鉀是常用的尿液堿化劑,是治療和預(yù)防泌尿系結(jié)石的常用藥物,可以抑制鹽結(jié)石(草酸鈣、磷酸鈣和尿酸)的形成和復(fù)發(fā)。許多研究表明枸櫞

7、酸鉀在治療和預(yù)防含鈣結(jié)石、尿酸結(jié)石有一定療效。本研究旨在建立三聚氰胺氰尿酸鹽腎結(jié)石模型,研究枸櫞酸鉀對(duì)三聚氰胺氰尿酸鹽腎結(jié)石的干預(yù)作用,為進(jìn)一步尋求防治方法及臨床上治療問(wèn)題奶粉所致泌尿系結(jié)石提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的:
　　 1.研究聯(lián)合灌胃三聚氰胺與三聚氰酸制造三聚氰胺氰尿酸鹽大鼠腎結(jié)石的模型的機(jī)制,提供一種新的復(fù)制大鼠腎結(jié)石模型的方法。
　　 2.研究枸櫞酸鉀對(duì)三聚氰胺氰尿酸鹽腎結(jié)石大鼠的干預(yù)機(jī)制。

8、>　　 研究方法:
　　 1.造模和分組
　　 將36只SD雄性大鼠隨機(jī)分成A組(空白對(duì)照組)、B組(三聚氰胺30mg·kg-1·d-1+三聚氰酸30mg·kg-1·d-1)、C組(三聚氰胺30mg·kg-1·d-1+三聚氰酸30mg·kg-1·d-1+枸櫞酸鉀1g·kg-1·d-1),每組12只,通過(guò)灌胃給藥。以上各藥均配置成2 ml液體每只每次灌胃。
　　 2.指標(biāo)的收集和檢測(cè)
　　 動(dòng)物飼養(yǎng)2周,

9、每天觀察動(dòng)物的一般情況,如飲食、活動(dòng)、尿液情況、精神狀態(tài)等。用代謝籠收集第1天、第14天24h尿液。取第1天尿液,涂片觀察尿液沉渣情況。取第14天尿液,測(cè)24h排尿量和尿pH值。14天后大鼠處死前稱體重,從下腔靜脈采血檢測(cè)血液肌酐、血尿素氮和血尿酸。取雙腎,稱雙腎重量,計(jì)算腎體比,腎體比=雙腎重/體重×100％。用外科顯微鏡觀察腎臟大體變化情況。取左腎進(jìn)行HE病理切片,并對(duì)腎臟病理切片觀察病理變化及三聚氰胺氰尿酸鹽結(jié)晶情況,并按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)

10、進(jìn)行分級(jí)。結(jié)晶的分級(jí)程度用半定量評(píng)估為:0級(jí):無(wú)任何結(jié)晶亮點(diǎn)；Ⅰ級(jí):很少的結(jié)晶亮點(diǎn)；Ⅱ級(jí):一些結(jié)晶亮點(diǎn)；Ⅲ級(jí):許多結(jié)晶亮點(diǎn),廣泛連接成片。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以 x±s表示。腎內(nèi)結(jié)晶評(píng)分采用非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))的Mann—whitney U檢驗(yàn)。尿液、血生化采用方差分析。當(dāng)P<0.05時(shí),表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.動(dòng)物一般情

11、況
　　 A組(空白組)大鼠飲食、活動(dòng)未見(jiàn)異常,精神狀態(tài)正常；但是在B組的情況明顯不同。B組(模型組)大鼠的癥狀表現(xiàn)為精神萎靡、嗜睡、進(jìn)食少、逐漸出現(xiàn)尿少,前三天時(shí)大多數(shù)老鼠出現(xiàn)肉眼血尿,并出現(xiàn)體重的減少；而C組(干預(yù)組)活動(dòng)度稍差、飲水量增加,并出現(xiàn)尿量增加,部分大鼠出現(xiàn)肉眼血尿。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未見(jiàn)大鼠死亡。
　　 2.腎臟大體標(biāo)本改變
　　 外科顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)A組大鼠腎臟表面光滑暗紅色,腎皮質(zhì)剖面呈

12、紅褐色,腎髓質(zhì)呈淺紅色,腎皮質(zhì)、髓質(zhì)無(wú)結(jié)晶形成；B組大鼠腎臟明顯腫大,外觀呈灰黃色,包膜有許多散在黃色斑點(diǎn),腎臟皮質(zhì)變薄,腎盞、腎盂結(jié)構(gòu)破壞,腎內(nèi)布滿淡黃色顆粒,可見(jiàn)沿髓線放射狀排列的黃色條索狀沉淀物,并在皮髓交界處形成一道明顯的淡黃色弧線；C組大鼠腎臟表面尚光滑,顏色為暗紅色,但亦可見(jiàn)少量暗黃色顆粒散布在腎臟表面,皮髓結(jié)構(gòu)尚清晰,有少量淡黃色顆粒沉積,顆粒結(jié)晶較B組明顯減少。
　　 3.腎重、體重、腎體比
　　 B組表

13、現(xiàn)為體重減輕,顯著低于A組和C組(P<0.05)；B組雙腎質(zhì)量增大,顯著高于A組和C組(P<0.05)。A組和C組腎重、體重、腎體比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.各組大鼠血尿生化
　　 B組大鼠24尿量、尿pH值,較A組、C組顯著減少,均為P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血液肌酐、血尿素氮、血尿酸較A組、C組顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組24h尿量、尿pH值較A組顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、(P<0.05)；C組血液肌酐、尿素氮與A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.尿沉渣檢測(cè)
　　 尿沉渣用偏光顯微鏡觀察?？瞻捉MA組未見(jiàn)明顯晶體及雜質(zhì)；B組可見(jiàn)較多的、呈淡黃色半透明的放射狀同心圓形晶體,大小不等,其中有部分晶體呈融合在一起的形態(tài)；C組也可見(jiàn)許多和B組一樣的晶體,同樣呈暗黃色半透明同心圓形狀。
　　 6.腎組織病理及結(jié)晶分級(jí)評(píng)分
　　 A組大鼠HE染色腎組織切片未見(jiàn)晶體形成,細(xì)胞排列

15、整齊,規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰,腎小管腔內(nèi)無(wú)沉積物,上皮細(xì)胞無(wú)腫脹充血腎乳頭腎盂腎盞清晰,腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)均無(wú)結(jié)石。對(duì)B組腎臟組織切片進(jìn)行觀察,可見(jiàn)到許多淡黃色、半透明、呈放射狀的同心圓或橢圓形結(jié)石晶體,這些晶體直徑范圍大約在10—200μm之間,有些結(jié)晶相互靠近,聚集在一起呈聯(lián)合擴(kuò)大的趨勢(shì),堵塞于腎小管;這些結(jié)晶主要集聚于腎小管,部分見(jiàn)于集合管、間質(zhì)及被膜下,偶見(jiàn)于腎小球囊中,大多晶體以不規(guī)則碎片出現(xiàn)于腎小管中,腎小管管腔明顯增大,顯著大于正常組

16、的腎小管的管腔；此外,腎小管上皮細(xì)胞受損,并出現(xiàn)各種管型和壞死細(xì)胞,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在在腎小球囊腔、腎小管及間質(zhì)中。C組同樣可見(jiàn)三聚氰胺氰尿酸結(jié)晶,結(jié)晶數(shù)量較模型組少,主要聚集在腎小管管腔中,直徑大約在10μm-50μm之間,少部分可見(jiàn)于集合管,間質(zhì)及被膜下很少見(jiàn)結(jié)晶沉積,腎小管損傷情況無(wú)B組明顯,可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞及壞死細(xì)胞。B組的平均結(jié)晶分級(jí)評(píng)分為(1.44±0.86),C組的各組結(jié)晶分級(jí)評(píng)分為(0.54±0.62),采用用非參數(shù)檢

17、驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))的Mann-Whitney U檢驗(yàn),Z=14.147,P=0.000,C組結(jié)晶平均分級(jí)得分顯著低于B組,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.三聚氰胺和三聚氰酸同時(shí)混合灌胃進(jìn)入體內(nèi),可形成三聚氰胺氰尿酸鹽腎結(jié)石晶體,利用三聚氰胺與三聚氰酸聯(lián)合灌胃可形成三聚氰胺尿酸鹽腎結(jié)石模型。
　　 2.利用枸櫞酸鉀對(duì)三聚氰胺氰尿酸鹽腎結(jié)石模型進(jìn)行干預(yù),可以抑制三聚氰胺氰尿酸鹽結(jié)石的形成。它的主要作用通過(guò)