氧化兩面針堿對(duì)垂體腺瘤GH3細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制非軍事化.pdf

1、背景：垂體腺瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的良性腫瘤，發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的10％，且近年呈增多趨勢(shì)。目前外科手術(shù)治療是垂體腺瘤最常見(jiàn)的治療方式，但仍有部分腫瘤類型如巨大腺瘤及侵襲性垂體腺瘤在臨床上無(wú)法全切。當(dāng)前治療垂體腺瘤的藥物品種少且不良反應(yīng)較多，垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，因此尋找高效、安全且毒副反應(yīng)小的垂體腺瘤治療藥物當(dāng)前是研究熱點(diǎn)。氯化兩面針堿是從中藥植物兩面針根中提純的一種生物堿，前期研究表明，氯化兩面針堿對(duì)多種腫瘤如肝癌、乳腺癌、腎癌等在體內(nèi)、外

2、均能夠發(fā)揮抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。目前氯化兩面針堿在垂體腺瘤中的作用及機(jī)制的研究較少。
　　目的：探討氯化兩面針堿對(duì)垂體腺瘤GH3細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡的影響并分析其具體機(jī)制，研究氯化兩面針堿對(duì)垂體腺瘤GH3細(xì)胞通路的影響，進(jìn)而探討氯化兩面針堿作為垂體腺瘤治療藥物的可能性。
　　方法：⑴細(xì)胞分組:依照氯化兩面針堿不同的給藥濃度將GH3細(xì)胞分為0μmol/l組、1μmol/l組、2μmol/l組、4μmol/l組和8μmo

3、l/l組，其中0μmol/l組為空白對(duì)照組。⑵細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn):氯化兩面針堿處理后CCK-8法檢測(cè)各組GH3細(xì)胞不同時(shí)間的存活率。⑶流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:氯化兩面針堿處理細(xì)胞24h后，AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組GH3細(xì)胞凋亡率。⑷流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析:氯化兩面針堿處理細(xì)胞12 h后，采用PI染色法用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。⑸RT-PCR法檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá):不同濃度氯化兩面針堿處理的細(xì)胞使用

4、TRIzol法提取總RNA，Real-time RT-PCR法檢測(cè)不同處理后凋亡相關(guān)基因Bax、 Bcl-2和細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin B1、CDK1、p21和p27的mRNA表達(dá)水平的改變。⑹Western bloting法檢測(cè)目的蛋白表達(dá):不同濃度氯化兩面針堿處理的細(xì)胞使用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。全細(xì)胞裂解液使用SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳，免疫印跡檢測(cè)B

5、ax、Bc`-2、CyclinB1、CDK1蛋白以及AKT和ERK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平。⑺統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，所得數(shù)據(jù)用(x)±s來(lái)表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①氯化兩面針堿對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響氯化兩面針堿對(duì)GH3細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且與劑量、時(shí)間呈正相關(guān)。②氯化兩面針堿對(duì)GH3細(xì)胞凋亡的影響氯化兩面針堿明顯增加了GH3細(xì)胞的凋亡率，且與劑量正相關(guān);氯化兩面針堿

6、處理后GH3細(xì)胞促凋亡分子Bax的mRNA表達(dá)水平明顯增加，而抗凋亡分子Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bax/Bcl-2的比值明顯增加。③氯化兩面針堿對(duì)GH3細(xì)胞周期的影響氯化兩面針堿使GH3細(xì)胞G2/M期比例增加;氯化兩面針堿處理后，GH3細(xì)胞Cyclin B1和CDK1的表達(dá)明顯降低，p21和p27表達(dá)明顯增加。④氯化兩面針堿對(duì)GH3細(xì)胞通路激活的影響氯化兩面針堿可降低GH3細(xì)胞AKT和ERK的磷酸化水平，抑制AKT和ERK