氯化兩面針堿對乳腺癌抑制作用及與阿霉素協(xié)同作用的研究.pdf

1、目的:乳腺癌是全世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，在我國它也是臨床中的常見病、多發(fā)病。圍繞其治療，臨床上提出了多種研究方向，其中藥用植物提取物的應(yīng)用為重要的研究策略之一，且其成果目前已廣泛應(yīng)用于臨床。兩面針堿來源廣泛，可自蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根中提取。氯化兩面針堿(Nitidine chloride)是兩面針堿經(jīng)氯化作用形成的一種特殊類型的生物堿，有實(shí)驗(yàn)研究表明其具有抗真菌，抗炎，抗氧化的功能，更有研究提示其有抗艾滋病的潛在功能。同

2、時早期研究發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿能夠抑制肝癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的增殖，還能夠通過抑制c-Src/focal adhesionkinase(FAK)有關(guān)的信號通路抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。建立乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231兩種模型，探討氯化兩面針堿及聯(lián)合化療藥物阿霉素后對以上兩種乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞毒性的影響。
　　方法:通過細(xì)胞活力試驗(yàn)(MTT assay)檢測細(xì)胞活力?？寺⌒纬稍囼?yàn)(Colonyformation assa

3、y)檢測單個細(xì)胞增殖能力。流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞周期(Cellcycle analysis)，分析氯化兩面針堿對乳腺癌細(xì)胞周期分布之影響。TUNEL試驗(yàn)(Terminal deoxynucleotidyl transferased UTP nick endlabeling assays)和凋亡檢測試驗(yàn)(Flow cytometric apoptosis assays)檢測氯化兩面針堿誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡作用的影響。線粒體膜電位分析(Me

4、asurement of themitochondrial membrane potential assays)檢測氯化兩面針堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Weston blot)檢測使用氯化兩面針堿后對乳腺癌經(jīng)典P53和AKT通路，及對細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。通過計(jì)算兩種藥物的聯(lián)合抑制率(CDI)，分析驗(yàn)證氯化兩面針堿與阿霉素在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231中的協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞毒性的作用。
　　結(jié)果

5、:通過細(xì)胞活力檢測試驗(yàn)(MTT assay)發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。流式細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)(Flow cytometric apoptosis assay)表明氯化兩面針堿可明顯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的早期凋亡，同時發(fā)現(xiàn)其可以引起G2/M期細(xì)胞周期阻滯(P＜0.05)。結(jié)合Annexin V/PI雙染色、TUNEL染色分析和JC-1線粒體膜電位分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)氯化兩面針堿可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，并發(fā)現(xiàn)是通過細(xì)

6、胞線粒體膜電位途徑發(fā)揮作用，同時具有時間和劑量依賴性(P＜0.05)。在分子機(jī)制方面，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞增殖的抑制作用同p53和p21蛋白的增加相關(guān)聯(lián)，并且具有時間和濃度依賴性。通過蛋白免疫印跡方法(westernblot analysis)，發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中可以上調(diào)促進(jìn)凋亡的蛋白Bax，cleavage-caspase-3，9和cleavage-PARP的表達(dá)，并且下調(diào)抗凋亡的蛋白Bcl-2，ca

7、spase-3和PARP的表達(dá)。應(yīng)用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002，發(fā)現(xiàn)抑制AKT的表達(dá)可以促進(jìn)氯化兩面針堿對乳腺癌細(xì)胞活力的影響，同時增強(qiáng)氯化兩面針堿對乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，進(jìn)一步的證實(shí)氯化兩面針堿可以通過抑制磷酸化的AKT而起到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖同時誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。最后通過MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞活性，統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)阿霉素和氯化兩面針堿聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。
　　結(jié)論:研究表明氯化兩面針堿在