大鼠腦缺血再灌注損傷后HIF-1α對膠質(zhì)亞型細(xì)胞修復(fù)重塑的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)采用體外重組技術(shù),制備pcDNA3.1-HIF-1α質(zhì)粒。將HIF-1α質(zhì)粒經(jīng)頸部頸外-頸內(nèi)動脈途徑注射入大腦中動脈缺血再灌注損傷的大鼠腦組織中,于6h、12h、24h、72h和7d時,取大鼠腦組織對神經(jīng)膠質(zhì)亞型細(xì)胞行特異性免疫組織化學(xué)染色,觀察各組亞型細(xì)胞的變化。分別將HIF-1α、VEGF同膠質(zhì)亞型細(xì)胞行熒光雙染色,于激光共聚焦顯微鏡下觀察共表達(dá)的情況。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價重組HIF-1α質(zhì)粒對于腦梗死的

2、治療效果,及其對多種細(xì)胞修復(fù)重塑的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1經(jīng)體外獲得的HIF-1α的cDNA,測序檢測后克克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,酶切鑒定重組子
　　 2大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注模型制作參照Zea Longa等報道的方法并加以改進(jìn)。10％水合氯醛腹腔麻醉,頸部正中切開,分離肌肉組織暴露頸部血管,經(jīng)頸外動脈向頸內(nèi)動脈插入線栓,線栓頭端距血管分叉處1.8cm左右視為線栓梗死大腦中動脈。2h后取

3、出線栓注入HIF-1α質(zhì)粒,留取6h、12h、24h、72h和7d觀察,對照組注入PBS;
　　 3將相應(yīng)時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠處死后斷頭取腦,視交叉后做2mm厚連續(xù)切片,第一片做TTC染色,其余做石蠟包埋,5μm厚連續(xù)石蠟切片,行HE染色并對各膠質(zhì)亞型細(xì)胞行特異的免疫組織化學(xué)染色,高倍鏡下分別計數(shù)不同時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組各膠質(zhì)亞型細(xì)胞的個數(shù);
　　 4將石蠟切片分別對HIF-1α、VEGF同各膠質(zhì)亞型細(xì)胞做免疫熒光雙

4、染色,于激光共聚焦顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞的重疊情況,分析膠質(zhì)亞型細(xì)胞是否存在與HIF-1α、VEGF的表達(dá);
　　 5統(tǒng)計學(xué)分析:使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間計量資料比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　 結(jié)果:
　　 1 RT-PCR擴(kuò)增HIF-1α cDNA,經(jīng)測序結(jié)果與Genebank記載完全一致,構(gòu)建并酶切鑒定后獲得pcDNA3.1-HIF-1α質(zhì)粒;

5、>　　 2大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷后,經(jīng)頸外動脈注射HIF-1α質(zhì)粒組與PBS組死亡率未見明顯差別,但是筆TTC染色見72h后,治療組腦梗死面積明顯小于對照組,而且存活7d大鼠神經(jīng)功能缺失評分明顯低于PBS對照組;
　　 3 HIF-1α對大鼠腦缺血再灌注后膠質(zhì)亞型細(xì)胞的影響:大鼠腦缺血再灌注6h、12h、24h、72h和7d,經(jīng)頸外動脈注射HIF-1α質(zhì)粒組的星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽性細(xì)胞)數(shù)量均數(shù)分別為12.20±2

6、.864、18.80±4.207、30.00±4.301、38.40±2.881和43.20±6.978,注射PBS組的數(shù)量均數(shù)為15.80±4.494、18.60±1.673、23.00±4.583、31.60±3.361和29.00±6.000,二者相同時間點(diǎn)陽性細(xì)胞均數(shù)做t檢驗(yàn)比較,缺血再灌注損傷24h及以后各時間點(diǎn),HIF-1α組與對照組陽性細(xì)胞數(shù)有差異(P＜0.05);經(jīng)頸動脈注射HIF-1α質(zhì)粒后,小膠質(zhì)細(xì)胞(Isolect

7、in-B4陽性細(xì)胞)均數(shù)分別為8.400±2.074、14.40±4.393、20.80±2.280、17.00±3.162和11.60±2.408,PBS對照組陽性細(xì)胞均數(shù)為8.400±2.302、15.40±2.402、25.80±4.147、37.80±6.181和24.80±4.325,相同時間點(diǎn)兩組陽性細(xì)胞均數(shù)做t檢驗(yàn)比較,缺血再灌注損傷24h及以后各時間點(diǎn)兩組間有差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。HIF-1α注射組少突膠質(zhì)

8、細(xì)胞(CNPase陽性細(xì)胞)均數(shù)分別為17.00±2.916、11.40±2.302、10.00±3.526、16.40±2.302和19.20±2.388,PBS對照組陽性細(xì)胞均數(shù)分別為16.60±2.408、10.60±2.074、7.200±1.924、4.000±1.581和13.20±2.388,二者相同時間點(diǎn)陽性細(xì)胞均數(shù)做t檢驗(yàn)比較,缺血再灌注損傷72h后,二組間陽性細(xì)胞數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異;
　　 4 HIF-1α、VE

9、GF與膠質(zhì)亞型細(xì)胞共表達(dá):將石蠟切片行免疫熒光雙染色,于激光共聚焦顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)大量星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽性細(xì)胞)與HIF-1α、VEGF蛋白存在共表達(dá)情況,而未見小膠質(zhì)細(xì)胞(Isolectin-B4陽性細(xì)胞)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(CNPase陽性細(xì)胞)中HIF-1α、VEGF明顯表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1經(jīng)頸外-頸內(nèi)動脈注射重組pcDNA3.1-HIF-1α質(zhì)?？梢杂行У臏p少大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織的梗死面積。