脂質(zhì)體槲皮素誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)化及可能機(jī)制的研究.pdf

1、背景：槲皮素(quercetin)是黃酮類化合物(flavanoid)的一個(gè)成員,化學(xué)名稱為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮(pentahydroxyflavone)。槲皮素在植物界分布廣泛,對(duì)正常細(xì)胞有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒,抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等多方面藥理作用,是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱門(mén)課題之一。由于槲皮素難溶于水,在體外研究可采用小于0.1％的二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,以終濃度為40μmol

2、/L的槲皮素溶液處理培養(yǎng)細(xì)胞,雖未對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生不良效應(yīng),但考慮到DMSO不適于體內(nèi)應(yīng)用的問(wèn)題。為解決該問(wèn)題,采用脂質(zhì)體(liposomal)包被藥物,以提高藥物的溶解性,并增加療效。食管鱗癌(esophageal squamous epithelial carcinoma,ESEC)是發(fā)生在食管鱗狀上皮組織的惡性腫瘤。我國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家之一。癌細(xì)胞的特征為具有抵抗低氧、化學(xué)藥物以及輻射等傷害而呈現(xiàn)失調(diào)的異常增殖能力,cycli

3、n D1高表達(dá),與增殖密切相關(guān)的PI3k/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不能被失活的PTEN抑癌基因所抑制。食管癌細(xì)胞過(guò)高表達(dá)的c-met,VEGF惡性標(biāo)志等為低氧條件下誘導(dǎo)形成的,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平可提供針對(duì)抗癌細(xì)胞和癌干細(xì)胞治療的靶點(diǎn)。有報(bào)道指出,氧化應(yīng)激(ROS)參與槲皮素誘導(dǎo)肝瘤細(xì)胞的凋亡。此外,槲皮素對(duì)非轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激反應(yīng),不但不會(huì)如化療藥物那樣傷及正常細(xì)胞,而且尚具有防癌效應(yīng)。因此槲皮素不但具有抗癌,而且具有防癌效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)

4、通過(guò)制備不同脂質(zhì)體槲皮素(liposomal quercetin,LQ),作用于Ecal09/9706細(xì)胞,應(yīng)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活性抑制的影響,檢測(cè)NO細(xì)胞化學(xué)活性和羥自由基水平,比較其對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用[氧化應(yīng)激包含反應(yīng)氧族,ROS(O2.-,H2O2,·OH)和反應(yīng)氮族,RNS(NO,ONOO-)兩者]。通過(guò)測(cè)定c-met,VEGF,cyclin D1和PTEN免疫組織化學(xué)反應(yīng)和免疫印跡,探討其對(duì)癌

5、細(xì)胞惡性逆轉(zhuǎn)化的效應(yīng)及可能機(jī)制。
　　目的：1.比較制備的不同脂質(zhì)體槲皮素對(duì)培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。2.觀察脂質(zhì)體槲皮素誘導(dǎo)人食管癌Ecal09/9706細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和對(duì)癌細(xì)胞惡性逆轉(zhuǎn)化效應(yīng)的影響,并探究?jī)烧唛g的關(guān)聯(lián)機(jī)制。
　　方法：1.主要采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體槲皮素,制備按一定比例的氯仿和甲醇溶解類脂物質(zhì)的脂質(zhì)體槲皮素LQ1,制備按同比例的氯仿和DMSO作為溶劑的脂質(zhì)體槲皮素LQ2。油紅-O染色觀察所制備的

6、脂質(zhì)體槲皮素的形態(tài)。用DMSO直接溶解槲皮素,制備非脂質(zhì)體槲皮素(non-liposomal quercetin,nLQ)。2.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脂質(zhì)體槲皮素對(duì)Ecal09/9706細(xì)胞活性的抑制率,實(shí)驗(yàn)分為四組:LQ1組、LQ2組、nLQ組、對(duì)照組。3.脂質(zhì)體槲皮素處理48h后的Ecal09/9706細(xì)胞,檢測(cè)NO細(xì)胞化學(xué)活性和用試劑盒檢測(cè)羥自由基水平。4.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PTEN,c-met,VEGF和cyclin D1,在脂質(zhì)體槲

7、皮素處理48h后Ecal09/9706細(xì)胞中表達(dá)及定位的改變。5.脂質(zhì)體槲皮素處理48h后的Ecal09/9706細(xì)胞,以Trizol試劑提取其總蛋白質(zhì),檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。6.將SDS-PAGE電泳膠轉(zhuǎn)膜于硝酸纖維素膜(NCM)上,對(duì)c-met,VEGF,cyclinD1和PTEN(以β-actin作為內(nèi)參照)進(jìn)行免疫印跡定性及半定量。7.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)變量數(shù)據(jù)以

8、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,不同處理組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,指標(biāo)間的相關(guān)性采用二元變量的相關(guān)分析。結(jié)果判斷以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.在脂質(zhì)體槲皮素的溶解度和均勻性方面:LQ2組優(yōu)于LQ1組。在油鏡下可見(jiàn)LQ2組的微粒呈均勻分布,紅色類脂物質(zhì)包圍著一個(gè)中心微粒的槲皮素。2.MTT檢測(cè)結(jié)果表明Eca-109和Eca-9706的細(xì)胞活性抑制率(suppressing rate,SR)依次為L(zhǎng)Q2組>LQ1

9、組>nLQ組>對(duì)照組,P<0.05。3.NO細(xì)胞化學(xué)活性呈藍(lán)色細(xì)顆粒分布于胞質(zhì)內(nèi),尤其周緣胞質(zhì)更明顯,其活性從高至低依次為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對(duì)照組,P<0.05。4.羥自由基檢測(cè)的數(shù)值由高至低排列為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對(duì)照組,P<0.05,四組NO細(xì)胞化學(xué)活性與羥自由基檢測(cè)的數(shù)值之間呈顯著正相關(guān),r109=0.956,P<0.05,r9706=0.957,P<0.05。5.在人食管癌Eca-109及-9706的

10、對(duì)照組細(xì)胞中c-met,VEGF,PTEN及cyclinD1的免疫反應(yīng)性(immunoreactivity,IR)呈棕色細(xì)顆粒。cyclin D1-IR及PTEN-IR主要分布于胞核,c-met-IR及VEGF-IR分布于胞質(zhì)/胞核。c-met及VEGF及cyclin D1的圖像掃描灰度均值從高至低為:對(duì)照組>nLQ組>LQ1組>LQ2組,P<0.05。PTEN的圖像掃描灰度均值正好相反,從高至低為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對(duì)照組

11、,P<0.05。6.c-met,VEGF,cyclin D1及β-actin的免疫印跡主帶分別為c-met,145 kDa;cyclin D1,36kDa;VEGF,21kDa和β-actin,42kDa。各印跡信號(hào)的數(shù)值為各主帶掃描灰度均值與各β-actin掃描灰度均值的比值,從高至低依次為:對(duì)照組>nLQ組>LQ1組>LQ2組,P<0.05。人食管癌Eca-109/9706細(xì)胞的PTEN免疫印跡信號(hào)掃描灰度均值低下,且呈現(xiàn)>55kD

12、a的一些突變細(xì)條帶;各組免疫印跡信號(hào)由高至低為:LQ2組>LQ1組>nLQ組>對(duì)照組,P<0.05。四組免疫印跡信號(hào)與免疫組化反應(yīng)性呈正相關(guān),r=0.89~0.95,P<0.05。
　　結(jié)論：1.按一定比例的氯仿和DMSO溶解類脂物質(zhì)制備的脂質(zhì)體槲皮素的溶解性、均勻性及藥效性比按同比例的氯仿和甲醇作為溶劑制備的生物學(xué)效應(yīng)為好。2.LQ2對(duì)Ecal09/9706細(xì)胞活性抑制率高于LQ1組。3.脂質(zhì)體槲皮素處理Ecal09/9706細(xì)