在體硅膠室在胰島移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、背景:
　　胰島細(xì)胞移植不僅可以改善1型糖尿病患者的血糖控制,避免強(qiáng)化胰島素治療導(dǎo)致的低血糖昏迷,而且能阻止甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病并發(fā)癥。臨床上胰島移植90％經(jīng)門(mén)靜脈移植到肝臟,但是移植過(guò)程中細(xì)胞丟失嚴(yán)重,胰島在肝臟不能長(zhǎng)期存活以及移植后容易發(fā)生立即經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),所以研究者希望能找到更合適胰島移植的部位。天然移植部位包括肺、肝、脾臟的血管內(nèi),胰腺、皮下、肌肉、骨、腎包膜、網(wǎng)膜囊等組織和器官內(nèi),免疫豁免區(qū)如大腦、胸腺、睪丸等已被探索

2、是否可以作為胰島移植部位。但是這些天然的移植部位若應(yīng)用于臨床時(shí)均存在很多不足,相比之下,利用人工裝置構(gòu)建胰島移植部位顯現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景。我們實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中構(gòu)建了一種在體硅膠室。這種由硅膠材料制作、中空、表面帶孔的室性裝置植入皮下后,組織液可通過(guò)室表面的孔聚集在室內(nèi)。對(duì)室內(nèi)組織液的成分進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)其中含有多種生長(zhǎng)因子,并且這些組織液能夠在體外支持多種細(xì)胞的存活及分裂增殖。此外將軟骨細(xì)胞/支架材料復(fù)合物放入在體硅膠室后,能構(gòu)建

3、出組織工程軟骨。這些研究結(jié)果表明,這樣一種室性裝置不僅能在體構(gòu)建出一定的物理空間供細(xì)胞移植,而且室內(nèi)聚集的組織液能夠維持細(xì)胞存活。因此我們認(rèn)為這種在體室性裝置有望作為內(nèi)分泌細(xì)胞的移植部位,尤其是對(duì)于主要受局部微環(huán)境中葡萄糖調(diào)控的胰島細(xì)胞。
　　目標(biāo):
　?、沤⒎蛛x和純化小鼠胰島的標(biāo)準(zhǔn)化方法;
　　⑵探討組織液體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞時(shí)是否可以維持其活力及功能;
　?、翘剿髟隗w硅膠室作為胰島移植部位的可行性;
　　

4、⑷觀察在體硅膠室內(nèi)移植胰島對(duì)糖尿病小鼠血糖的調(diào)控。
　　方法:
　　⑴胰島獲取:采用在體膽總管灌注膠原酶P(1.3U/ml)方法,分離 C57BL/6J小鼠胰島,Histopaque1077密度梯度離心及手檢胰島兩步法純化胰島。
　?、俨捎肈TZ染色法鑒定胰島,計(jì)算每只胰腺的產(chǎn)出。
　?、谄咸烟谴碳ひ葝u素分泌實(shí)驗(yàn),計(jì)算葡萄糖刺激指數(shù),評(píng)估胰島的內(nèi)分泌功能。
　?、企w外實(shí)驗(yàn):①將硅膠室植入小鼠背部,定期收集室

5、內(nèi)組織液備用。
　?、谛∈笠葝u細(xì)胞培養(yǎng):分別用含5.5mM和11mM葡萄糖濃度的組織液與 RPMI1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清)體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞2周,AO-PI染色鑒定胰島細(xì)胞活性,葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)評(píng)估胰島細(xì)胞功能。
　?、强尚行匝芯?①硅膠室內(nèi)組織液糖與血糖關(guān)系的研究:腹腔注射葡萄糖,分別在0、15、30、60、90、120min檢測(cè)血糖及室內(nèi)組織液中葡萄糖水平并做分析。
　?、谑覂?nèi)胰島素調(diào)控血糖的研究:研

6、究不同給藥途徑(硅膠室內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi))下血糖的變化。
　　⑷體內(nèi)研究:①采用鏈脲佐菌素按200g/kg體重單次腹腔注射誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型。
　?、谝葝u細(xì)胞移植2周前于小鼠背部植入硅膠室。
　?、蹖?shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組(正常小鼠植入或不植入硅膠室),糖尿病對(duì)照組(糖尿病小鼠植入或不植入硅膠室),硅膠室內(nèi)胰島移植組及及腎包膜下胰島移植組。
　?、芤浦埠笄?周測(cè)隨機(jī)血糖,移植第5周行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn),之后取材做H

7、E染色及免疫組化染色。
　?、山y(tǒng)計(jì)方法:用統(tǒng)計(jì)軟件Prism5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算各組的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤,完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)采用One-way ANOVA與Tukey’s檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的相互比較,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析,曲線下面積由統(tǒng)計(jì)軟件按梯形規(guī)則計(jì)算得到。認(rèn)為P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　?、懦晒Ψ蛛x純化胰島細(xì)胞:
　?、俳?jīng)密度梯度離心及手檢胰島兩步法純化得到的胰島細(xì)胞純度

8、較高。
　?、诿恐灰认倨骄a(chǎn)出胰島細(xì)胞約145±27.5個(gè)。
　?、鄯蛛x的胰島細(xì)胞葡萄糖刺激指數(shù)SI為4.04±0.9。
　?、平M織液能在體外維持胰島細(xì)胞的存活及功能:
　?、傩∈笤隗w硅膠室內(nèi)組織液色淡黃、呈清亮狀,組織液中葡萄糖濃度為5.5mM。
　　②胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)2周時(shí),組織液培養(yǎng)組中胰島細(xì)胞外緣細(xì)胞突起較少,而RPMI1640培養(yǎng)組中細(xì)胞向外伸展形成較大的觸角。
　　③組織液組(5.5mM)

9、、組織液組(11 mM)、RPMI1640培養(yǎng)組(11 Mm)、RPMI1640培養(yǎng)組(5.5mM)活細(xì)胞率分別為91%、84%、76%和63%。
　?、芨鹘M的葡萄糖刺激指數(shù)(SI)分別為3.81±0.72,2.72±0.63,2.63±0.81,1.33±0.79。組織液體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞時(shí),細(xì)胞的形態(tài)、活力及功能均好于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液;而且含5.5mM葡萄糖的組織液優(yōu)于含11mM葡萄糖的組織液,但是含11

10、mM葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液優(yōu)于含5.5mM葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液。
　?、窃隗w硅膠室內(nèi)組織液中葡萄糖的變化能反應(yīng)血糖的變化,只是血糖在短時(shí)間內(nèi)劇烈升高時(shí),組織液中葡萄糖升高時(shí)間上相對(duì)滯后于血糖;室內(nèi)胰島素可以調(diào)控全身血糖。
　?、賁TZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模成功率為81%。
　　②糖負(fù)荷前,血糖與硅膠室中組織液中葡萄糖濃度分別為3.9±1.3 mmol/L和3.0±1.1mmol/L,兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>

11、0.05)。糖負(fù)荷15min時(shí),血糖在這一時(shí)間內(nèi)快速上升至17.2±2.3 mmol/L,而硅膠室內(nèi)組織液中葡萄糖濃度為7.8±1.9 mmol/L,兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),糖負(fù)荷30min時(shí),兩者均達(dá)到峰值。之后,血糖與室內(nèi)組織液中葡萄糖濃度緩慢下降,在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　③在體硅膠室內(nèi)胰島素在降血糖的時(shí)間和效應(yīng)方面,與皮下注射、腹腔注射沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　?、仍隗w硅膠室

12、內(nèi)移植胰島后可逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠高血糖:
　?、僖葝u素、胰高血糖素免疫組化染色證實(shí)硅膠室內(nèi)及腎包膜下移植胰島細(xì)胞形態(tài)及功能維持良好。
　?、陔S機(jī)血糖檢測(cè)結(jié)果顯示胰島細(xì)胞移植到在體硅膠內(nèi)可逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠高血糖。
　?、跧PGTT中,硅膠室內(nèi)胰島移植組血糖變化趨勢(shì)與腎包膜下胰島移植組及正常對(duì)照組基本一致。
　?、芴秦?fù)荷0-15min,硅膠室內(nèi)胰島移植組血漿中胰島素總量低于腎包膜下胰島移植組及植入硅膠室的正常對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)差異(P<0.05)。硅膠室胰島移植組胰島素 AUC0-15和AUC15-30分別低于腎包膜下胰島移植組38%和15%,但兩組胰島素AUC30-60和AUC0-120沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　?、萏秦?fù)荷15min時(shí),血中葡萄糖濃度高于硅膠室內(nèi)組織液中的葡萄糖濃度,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。之后各時(shí)間點(diǎn),組織液中葡萄糖濃度與血糖濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);糖負(fù)荷30min時(shí),胰島移植組室內(nèi)組織液中葡萄糖濃度達(dá)峰

14、值,胰島素濃度也達(dá)峰值。此時(shí),胰島移植組室內(nèi)組織液中葡萄糖濃度與植入硅膠室的糖尿病對(duì)照組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而胰島素遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　⑴小鼠胰島細(xì)胞的分離和純化過(guò)程復(fù)雜,操作中需注意每個(gè)細(xì)節(jié)。
　?、票狙芯渴状斡媒M織液體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞,證實(shí)這種培養(yǎng)液比最常用的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液(葡萄糖11mM)更利于維持細(xì)胞存活及功能,且組織液作為天然的

15、細(xì)胞賴以生存的環(huán)境,用組織液體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞能更好的研究胰島細(xì)胞生理病理的變化。
　?、潜狙芯渴状螌?duì)這種擴(kuò)散型裝置內(nèi)組織液中葡萄糖與血糖的關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)硅膠室內(nèi)組織液中葡萄糖的變化能反應(yīng)血糖的變化,只是在血糖短時(shí)間內(nèi)劇烈升高時(shí),組織液中葡萄糖升高時(shí)間上相對(duì)滯后于血糖;而室內(nèi)胰島素通過(guò)特定途徑可以調(diào)控全身血糖。
　?、缺狙芯康贸鲅芑囊葝u與依靠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散存活的胰島在調(diào)控糖代謝方面的差異,血管化的胰島能及時(shí)的對(duì)血糖升高做