ELISA-CDC技術(shù)在腎移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景:目前臨床上開展的組織器官移植中絕大多數(shù)屬于無血緣關(guān)系供受體之間的同種異體移植。由于人類HLA系統(tǒng)為高度多態(tài)性,在人群中難以找到與受體HLA完全相同的供者,因此同種異體器官移植都有可能發(fā)生排斥反應(yīng)。為了減少排斥反應(yīng)、提高移植成功率、延長移植物有功能存活,移植前嚴(yán)格進(jìn)行組織配型,對(duì)供受者進(jìn)行免疫學(xué)選配就非常重要。移植供受體選擇的免疫學(xué)因素包括:①ABO血型相容原則；②HLA配型；③交叉細(xì)胞毒試驗(yàn)；④群體反應(yīng)性抗體檢測(cè)。
　　

2、 人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigens,HLA)被稱為移植基因,HLA組織配型包括:①HLA抗原分型；②HLA抗體分析,即對(duì)群體反應(yīng)性HLA抗體的識(shí)別(panel reaction antibody,PRA)和抗供者特異性HLA抗體的分析(complement-dependent cytotoxicity,CDC)。檢測(cè)受者血清中HLA抗體特異性(PRA)用以識(shí)別受者不能接受的HLA抗原,檢測(cè)受者血清中特異

3、性抗供者HLA的抗體(CDC)用以識(shí)別受者可以接受的HLA抗原。CDC是腎移植術(shù)前、術(shù)后主要的組織相容性實(shí)驗(yàn)之一,是移植前供受體選擇的最重要的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn),對(duì)預(yù)防超急性及加速性排斥反應(yīng)、監(jiān)測(cè)受者免疫狀態(tài)、減少免疫抑制劑毒副作用及提高移植腎及移植受者近遠(yuǎn)期有功能存活率有重要意義,CDC陽性被認(rèn)為是移植的絕對(duì)禁忌癥。移植前受者體內(nèi)如果存在抗供者特異性抗體(donor specificanti-HLA antibodies,DSA),抗體介導(dǎo)的

4、排斥反應(yīng)(AMR)極有可能導(dǎo)致移植腎的早期失功。病人的循環(huán)抗體水平會(huì)隨血液透析頻率、效果而波動(dòng)變化以及/或病人接受了輸血或其它形式(再次移植、妊娠)的致敏,即使用病人當(dāng)前血清進(jìn)行移植前交叉配型為陰性,但由于病人存在記憶性免疫應(yīng)答,仍會(huì)引起超急性排斥和(或)早期移植腎失功,因此有必要對(duì)移植術(shù)后受者血清進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。目前用于CDC的方法主要包括補(bǔ)體依賴淋巴細(xì)胞毒交叉配型方法(NIH-CDC)和流式細(xì)胞交叉配型方法(FCXM),CDC結(jié)果為陽

5、性時(shí)也可能獲得較好的移植腎/受者近遠(yuǎn)期有功能存活率；相反地,CDC結(jié)果為陰性時(shí),移植腎也可能發(fā)生早期失功。NIH-CDC和FCXM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與移植后效果常不相符,其可靠性欠佳,ELISA-PRA能更準(zhǔn)確地反映受者體內(nèi)的致敏情況,PRA強(qiáng)度與移植腎存活率有關(guān),但ELISA-PRA檢測(cè)出的抗體不一定是針對(duì)供者的特異性抗體。目前研究表明ELISA法比CDC法在檢測(cè)HLA抗體中有較強(qiáng)的敏感性和特異性,ELISA法具有測(cè)定結(jié)果客觀,重復(fù)性好；只能

6、檢測(cè)特異性抗HLA-IgG抗體,不受其他抗體的干擾;既可測(cè)定補(bǔ)體結(jié)合的HLA抗體,也可測(cè)定非補(bǔ)體結(jié)合的HLA抗體；不需要活的淋巴細(xì)胞,大大方便了臨床應(yīng)用等優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是目前HLA抗體篩選技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前國內(nèi)外許多器官移植中心傾向于在移植術(shù)前分別采用兩種交叉配型方法檢測(cè),以提高對(duì)DSA的識(shí)別能力,預(yù)防嚴(yán)重排斥反應(yīng)的發(fā)生,常用的組合包括NIH-CDC+AHG-CDC或NIH-CDC+FCXM等,因此建立一種新的交叉配型方法也方便臨床上

7、根據(jù)需要選擇。因此可以考慮依據(jù)ELISA原理建立一種新的CDC實(shí)驗(yàn)方法,以更好地預(yù)測(cè)排斥反應(yīng)。
　　 目的:為了提高對(duì)DSA識(shí)別的敏感性和特異性,為移植術(shù)前、術(shù)后提供一種DSA的監(jiān)測(cè)方法,更好地預(yù)測(cè)排斥反應(yīng),本研究利用國內(nèi)各器官移植實(shí)驗(yàn)室已有的組織配型實(shí)驗(yàn)條件,不需增加特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備,創(chuàng)新性建立ELISA-CDC實(shí)驗(yàn)技術(shù),對(duì)已知HLA抗體特異性的PRA陽性血清進(jìn)行ELISA-CDC實(shí)驗(yàn),以比較ELISA-CDC與ELISA-PRA

8、在同一特異性HLA抗體識(shí)別上的吻合率,探討其在移植前供受者交叉配型及移植術(shù)后監(jiān)測(cè)DSA中的應(yīng)用價(jià)值,并對(duì)2010年1月～2010年12月間接受同種異體腎臟移植受者以NIH-CDC陰性為移植入選標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)NIH-CDC為陰性時(shí),若ELISA-CDC陽性則排除患者接受此器官,密切觀察受者移植術(shù)后的病情變化,注意有無超急性排斥反應(yīng)或加速性排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　 方法
　　 1.研究對(duì)象
　　 1.1.實(shí)驗(yàn)方法的建

9、　　 (1)供者淋巴細(xì)胞的提取和淋巴細(xì)胞裂解物的制備；
　　 (2)實(shí)驗(yàn)質(zhì)控系統(tǒng)的建立:試劑質(zhì)控、溶解質(zhì)控和陰性質(zhì)控,用酶標(biāo)儀讀取吸光度A值,通過對(duì)比陰性對(duì)照的OD值來確定陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本；
　　 (3)依據(jù)ELISA原理,特異性檢測(cè)。
　　 1.2.實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證
　　 1.2.1.標(biāo)本的采集所有標(biāo)本選自5例已知HLA基因的淋巴細(xì)胞和24例已知HLA抗體特異性的ELISA-PRA陽性血清。24例已知

10、HLA抗體的PRA陽性血清分為95份分別和針對(duì)性HLA-A、B、DR基因的淋巴細(xì)胞為第一組,其中與相應(yīng)針對(duì)性HLA-A、B基因淋巴細(xì)胞的為51份,與針對(duì)性HLA-DR基因的淋巴細(xì)胞的為44份；24份已知HLA抗體的血清和無針對(duì)性HLA-A、B、DR基因的淋巴細(xì)胞為第二組,其中與無相應(yīng)針對(duì)性HLA-A、B基因的淋巴細(xì)胞的為13份,與無針對(duì)性HLA-DR基因的淋巴細(xì)胞的為11份；35份PRA-Ⅰ類或Ⅱ類陰性血清為陰性對(duì)照組,其中PRA-Ⅰ類

11、陰性的為20份,PRA-Ⅱ類陰性的為15份。
　　 1.2.2.統(tǒng)計(jì)結(jié)果的處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄分析,兩種檢測(cè)方法之間采用配對(duì)x2驗(yàn)(McNemar)。兩種檢測(cè)方法之間吻合度行Kappa檢驗(yàn)。P≤0.05判斷為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.3.臨床移植受者的觀察和統(tǒng)計(jì)
　　 1.3.1.臨床移植受者的觀察對(duì)2010年1月～2010年12月間接受同種異體腎臟移植受者以NIH-CD

12、C陰性為移植入選標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)NIH-CDC為陰性時(shí),若ELISA-CDC陽性則排除患者接受此器官。密切觀察受者移植術(shù)后的病情變化,注意有無超急性排斥反應(yīng)或加速性排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　 1.3.2.統(tǒng)計(jì)結(jié)果的處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄分析,PRA陽性組和陰性組之間采用兩個(gè)獨(dú)立樣本率比較的x2檢驗(yàn)。P≤0.05判斷為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1.捕獲抗原:用淋巴細(xì)胞

13、分離液從供者靜脈血中分離出淋巴細(xì)胞,再用淋巴細(xì)胞裂解液裂解,分裝后立即使用或放入-80℃溫度下保存。
　　 2.2.ELISA實(shí)驗(yàn):從4℃冰箱中取出所有試劑,平衡至室溫,取出板條,記錄紙上標(biāo)記陰性對(duì)照、裂解物對(duì)照、陽性對(duì)照及空白孔的位置。測(cè)Ⅰ類抗體的裂解液用裂解和耦聯(lián)稀釋液(LCD)8倍稀釋,測(cè)Ⅱ類的用LCD4倍稀釋,干淋巴細(xì)胞對(duì)照裂解物用LCD4倍稀釋。除指定作為陽性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔外,其余各孔均加入已稀釋的供者淋巴細(xì)胞裂解

14、物15ul,陽性對(duì)照孔中加入“對(duì)照細(xì)胞裂解物”,空白孔不加任何試劑,37℃溫箱孵育30min,取出甩干,洗板4次。用標(biāo)本稀釋液(SD)1:3稀釋受者血清和陰、陽性對(duì)照,相應(yīng)孔內(nèi)加入已稀釋血清15ul,裂解物對(duì)照孔中加入15ul LCD,37℃溫箱孵育30min,取出甩干,洗板4次。用SD1:100稀釋Anti-IgG抗體,用LCD1:100稀釋裂解對(duì)照試劑LCR1和LCR2,除空白和裂解物對(duì)照孔外,每孔各加15ul已稀釋的Anti-Ig

15、G抗體,Ⅰ類和Ⅱ類裂解物對(duì)照孔分別加入已稀釋的LCR1、LCR2各15ul,置37℃溫箱孵育30分鐘,取出甩干,洗板4次。用0.5ml去離子水溶解對(duì)硝基苯磷酸(PNPP)粉末,每一條加0.5ml酶底物溶液和5ul PNPP溶液,除空白孔外,每孔加已稀釋的酶底物溶液50ul,22-25℃避光反應(yīng)30min,各孔加入50ul終止液,空白對(duì)照孔加100ul終止液。30min內(nèi)在波長為405nm的酶標(biāo)儀上讀取吸光度A值。
　　 2.3.

16、結(jié)果判斷與分析:通過對(duì)比陰性對(duì)照的OD值來鑒定陽性及陰性標(biāo)本。根據(jù)在波長為405nm的酶標(biāo)儀上讀取吸光度A值,樣本檢測(cè)值≥2倍陰性對(duì)照值,則判為陽性；樣本檢測(cè)值<2倍陰性對(duì)照值,則判為陰性。
　　 結(jié)果
　　 1.實(shí)驗(yàn)方法的建立
　　 (1)淋巴細(xì)胞的裂解產(chǎn)物可以置于-80℃冷凍保存,以供2年內(nèi)使用,可作回顧性淋巴細(xì)胞毒交叉配型實(shí)驗(yàn)和移植術(shù)后免疫學(xué)監(jiān)測(cè)；
　　 (2)實(shí)驗(yàn)時(shí)間:平均每次ELISA-CDC需

17、時(shí)2.5～3h；
　　 (3)實(shí)驗(yàn)的整套檢測(cè)系統(tǒng)包括3套質(zhì)控:試劑質(zhì)控、溶解質(zhì)控和陰性質(zhì)控,用酶標(biāo)儀讀取吸光度A值,結(jié)果穩(wěn)定客觀；
　　 (4)測(cè)定結(jié)果:ELISA測(cè)定顯示裂解物對(duì)照孔A值>0.900,表明足量的HLA糖蛋白已被捕獲；試劑對(duì)照孔A值>1.000,說明試劑系統(tǒng)工作正常；陰性對(duì)照孔A值<0.300；
　　 (5)從供者的淋巴細(xì)胞裂解物中提取HLA-Ⅰ類和Ⅱ類抗原,并借助特異性單克隆抗體將其固化在ELI

18、SA板上,與受者血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng),特異性檢測(cè)HLA-IgG抗體,IgM、IgA抗體和非特異性抗供者HLA-IgG抗體會(huì)因不結(jié)合而被洗掉,排除了非HLA抗體、非IgG類抗體和非供者特異性抗體的影響；
　　 (6)ELISA-CDC使用的是供者淋巴細(xì)胞的裂解產(chǎn)物,不受淋巴細(xì)胞活力影響；
　　 (7)一種裂解產(chǎn)物能分別檢測(cè)出特異性的HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗體,在強(qiáng)Ⅰ類抗體存在時(shí)能檢測(cè)到Ⅱ類抗體；
　　 (8)既能檢測(cè)

19、補(bǔ)體結(jié)合抗體,也能檢測(cè)非補(bǔ)體結(jié)合抗體。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證:選自ELISA-PRA陽性血清,24例已知HLA抗體的血清分為95份分別和針對(duì)性HLA-A、B、DR基因的淋巴細(xì)胞ELISA-CDC實(shí)驗(yàn)為第一組,其中與針對(duì)性HLA-A、B基因的淋巴細(xì)胞的為51份,與針對(duì)性HLA-DR基因的淋巴細(xì)胞的為44份,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；24份已知HLA抗體的PRA陽性血清和無針對(duì)性HLA-A、B、DR.基因的淋巴細(xì)胞ELISA-CDC實(shí)驗(yàn)

20、為第二組,其中與無針對(duì)性HLA-A、B基因的淋巴細(xì)胞的為13份,與無針對(duì)性HLA-DR基因的淋巴細(xì)胞的為11份,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；35份PRA-Ⅰ類或Ⅱ類陰性血清與上述2組淋巴細(xì)胞ELISA-CDC實(shí)驗(yàn)為陰性對(duì)照組,其中PRA-Ⅰ類陰性的為20份,PRA-Ⅱ類陰性的為15份,實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦為陰性。ELISA-CDC與ELISA-PRA對(duì)同一特異性HLA抗體的識(shí)別采用配對(duì)x2檢驗(yàn)(McNemar),P=1.000,表明ELISA-CDC與EL

21、ISA-PRA對(duì)同一特異性HLA抗體的識(shí)別的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種檢測(cè)方法之間的吻合度行Kappa檢驗(yàn),Kappa=1.000,P<0.001,表明兩種方法的吻合度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且吻合度極強(qiáng)。
　　 3.臨床移植受者的觀察:以NIH-CDC陰性為腎臟移植入選標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)NIH-CDC為陰性時(shí),若ELISA-CDC陽性則排除患者接受此器官。期間共有101例受者接受了同種異體腎臟移植,其中男性74例,女性27例；PRA陰性85例,PRA

22、陽性16例。密切觀察移植受者術(shù)后的病情變化,PRA陰性受者和PRA陽性受者移植術(shù)后均未發(fā)生超急性排斥反應(yīng)或加速性排斥反應(yīng)。PRA陽性組和陰性組之間采用兩個(gè)獨(dú)立樣本率比較的x2檢驗(yàn),P=1.000,表明PRA陽性組和陰性組之間發(fā)生排斥反應(yīng)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:目前用于CDC的方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與移植后效果常不相符,其可靠性欠佳,ELISA-PRA能更準(zhǔn)確地反映受者體內(nèi)的致敏情況。ELISA-CDC和ELISA-PRA均是依

23、據(jù)ELISA原理,排除了非HLA抗體和非IgG類抗體的影響。ELISA.CDC能夠表達(dá)出與ELISA-PRA一致的HLA抗體特異性。在方法學(xué)上,ELISA-CDC具有比NIH-CDC敏感性高,比FCXM準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)。雖然PRA強(qiáng)度與移植腎存活率有關(guān),但ELISA-PRA檢測(cè)出的抗體不一定是針對(duì)供者的特異性抗體,ELISA-CDC是從供者的淋巴細(xì)胞裂解產(chǎn)物中提取HLA抗原,排除了非供者特異性抗體的影響。
　　 ELISA-CDC

24、較目前用于CDC的實(shí)驗(yàn)方法還具有如下優(yōu)勢(shì):ELISA-CDC使用的是供者淋巴細(xì)胞的裂解產(chǎn)物,不受細(xì)胞活力影響；ELISA-CDC結(jié)果穩(wěn)定而客觀,有可能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程的自動(dòng)化；一種裂解產(chǎn)物能分別檢測(cè)出特異性的Ⅰ、Ⅱ類抗體,在強(qiáng)Ⅰ類抗體存在時(shí)能檢測(cè)到Ⅱ類HLA抗體；治療性免疫抑制劑不會(huì)影響結(jié)果；ELISA-CDC可以提純供者HLA抗原低溫長期保存,不僅便于移植前多個(gè)受者與單一供者交叉配型,而且便于移植術(shù)后使用同一供者HLA基因進(jìn)行監(jiān)測(cè)DSA。

25、
　　 ELISA-CDC可能比較準(zhǔn)確地反應(yīng)了受者體內(nèi)的致敏狀態(tài),當(dāng)NIH-CDC為陰性時(shí)根據(jù)ELISA-CDC陽性排除此病人接受此器官移植,可有效地降低超急性和加速性排斥反應(yīng)的發(fā)生率,為移植受者特別是PRA陽性受者尋找合適的供體提供了一種較為可靠的交叉配型方法。此外,ELISA-CDC操作簡(jiǎn)單易行,耗時(shí)也不長。當(dāng)HLA特異性不確定或者目前CDC方法的陽性結(jié)果需要進(jìn)一步證實(shí)時(shí),ELISA-CDC的結(jié)果也可以做為重要的參考依據(jù)。E

26、LISA-CDC在移植前供受者交叉配型及移植術(shù)后監(jiān)測(cè)DSA中均具有一定的優(yōu)勢(shì),在臨床上有推廣價(jià)值。
　　 本研究中ELISA-CDC實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ELISA-PRA完全吻合,可能與樣本量不足有關(guān),所以進(jìn)一步的研究可以考慮加大樣本量。本研究僅進(jìn)行了ELISA-CDC與ELISA-PRA的吻合率比較,及觀察術(shù)前ELISA-CDC陰性受者術(shù)后有無超急性排斥反應(yīng)或加速性排斥反應(yīng)的發(fā)生,暫時(shí)未將ELISA-CDC方法應(yīng)用于移植術(shù)后的監(jiān)測(cè),觀察