微量透析評估豬心臟死亡供肝缺血損傷程度的研究.pdf

1、前言：
　　器官移植是治療終末期疾病的有效手段。然而近年來，器官緊缺已成為制約我國器官移植發(fā)展的瓶頸問題。因此盡快建立既符合中國國情，又被國際社會廣泛認可的人體器官捐獻體系已成為我國器官移植界當前面臨的首要問題。心臟死亡供者(Donor after Cardiac Death, DCD)器官移植是目前我國乃至國際上最有前景的器官來源途徑，但由于該類器官熱缺血時間較長，從一定程度上會影響移植物功能及預后。因此，基于我國臨床實踐基礎上

2、，如何準確評估DCD器官的熱缺血損傷，最大程度的開發(fā)利用現(xiàn)有供體資源，提高移植手術數(shù)量，是器官移植工作者要解決的重大課題。
　　移植物在器官保存過程中，都會因缺血缺氧造成一定程度的細胞損傷，從而影響移植后移植物的功能。并且隨著冷熱缺血時間的延長，移植物的功能受損程度隨之升高。因此，出于安全性原則考慮，對于冷熱缺血時間過長的供器官，移植醫(yī)生多會盡量避免使用。但是，目前尚無準確、公認的標準來評估DCD器官缺血損傷情況。因此，對于處在邊

3、緣狀態(tài)的供器官，臨床工作中尚無法對其移植預后進行正確的評估而加以有效利用。另一方面，移植物術后功能狀態(tài)受多種因素影響，除了冷熱缺血時間的長短，還包括移植物本身質量等，這些因素綜合作用、相互影響，最后集中體現(xiàn)在移植物的微環(huán)境代謝變化上，直接影響移植物功能狀態(tài)。因此，若能對移植物在手術前后的微環(huán)境代謝變化進行實時監(jiān)測，可有效判斷預后，并對移植物加以最大限度的利用。
　　微量透析技術是一種可以對活體進行動態(tài)微量取樣的新技術。其主要原理為

4、:將一種具有透析作用的、半透膜性質的微細探針置于供器官內，利用一部非常精細的注射泵，推送交換液至探針處，以達到與組織內欲取出測量的低分子量或高分子量物質，進行透析交換，再將透析液做進一步的分析。該技術具有活體取樣，動態(tài)觀察，定量分析，采樣量小，組織損傷輕等特點。利用微量透析技術對移植物微環(huán)境代謝進行動態(tài)監(jiān)測可以達到以下幾個目的:一、可以有效評估與冷、熱缺血損傷相關的參考指標，考量其與供器官功能障礙的的相關性，并根據(jù)大樣本研究，總結出相關

5、指標的參考范圍;二、對冷、熱缺血時間較長的器官或其他邊緣供體，可根據(jù)內環(huán)境變化，預測移植效果，并有及時采取對癥治療和預防性治療;三、有助于研究缺血再灌注損傷和原發(fā)性移植物功能障礙的機制;四、提高供器官的利用率和移植效果，為更多患者施行手術。
　　目的：
　　本研究以豬為實驗對象，制作DCD供肝模型，利用微量透析技術監(jiān)測不同生化指標（葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油）在不同冷、熱缺血時間段的變化，同時評估冷熱缺血時間段供肝組織病理學

6、變化，從而分別篩選出與DCD供肝熱冷缺血及冷缺血損傷程度相關的指標。
　　方法：
　　1、建立豬DCD供肝模型
　　小型豬全麻后，經口氣管插管接呼吸機輔助通氣，監(jiān)測血壓變化，序貫行撤機拔管，即窒息法建立豬DCD供肝模型。
　　2、微量透析技術的應用
　　(1)探針插入取樣
　　微量透析所用導管(直徑0.6mm)是半透膜制成的雙層同心管(CMA61 LiverMD Catheter，CMA Microd

7、ialysis，Stockholm, Sweden)，插入肝臟實質，將探針用4/0線固定。導管與纖維注射泵相連（CMA106 Microinfusion Pump:CMAMicrodialysis AB，Stockholm, Sweden），持續(xù)灌注交換液（交換液成分:Na+147mmol/L，K+4mmol/L，Ca2+2.3 mmol/L;滲透壓濃度290mOsm/kg; pH6;交換液購自CMA Microdialysis AB，

8、Stockholm，Sweden)。交換液依次通過內膜與透析膜，分子在細胞外液與灌注液之間進行擴散。
　　(2)程序設置
　　初始6分鐘灌注速度15μl/min，旨在排出系統(tǒng)內氣泡，防止破壞組織細胞，之后灌注速度控制在熱缺血2μl/min。冷缺血時灌注速度0.3μl/min。
　　3、不同冷、熱缺血時段的確定和需檢測的代謝產物及組織病理學改變
　　(1)取樣時間
　　熱缺血時間5分鐘，10分鐘，15分鐘，2

9、0分鐘，25分鐘，30分鐘各取樣一次，同一時間點組織學病理取樣一次。
　　冷缺血時間1小時，2小時，3小時……24小時，各取樣一次，同一時間點組織學病理取樣一次。
　　(2)檢測項目
　　乳酸、丙酮酸、葡萄糖、甘油、乳酸與丙酮酸比值。
　　(3)樣本檢測
　　采用CMA600型微量透析儀對所得樣本進行分析。
　　4、統(tǒng)計學分析
　　ROC曲線、Spearman相關性分析:結合組織病理學改變，總結

10、出冷熱缺血時間相關的代謝產物。
　　結果：
　　1、隨著熱缺血時間的延長，供肝組織形態(tài)學損傷進行性加重;葡萄糖水平隨熱缺血時間延長而升高，丙酮酸水平在熱缺血早期升高，隨缺血時間延長變化不明顯，甘油水平隨熱缺血時間延長，逐漸升高;乳酸水平在熱缺血20分鐘后明顯升高;乳酸與丙酮酸比值在熱缺血20分鐘后明顯升高。乳酸的表達量以及乳酸/丙酮酸的比值，隨熱缺血時間的延長而增高，各時間點的比較有統(tǒng)計學差異（均為P＜0.001）。

11、　　2、隨著冷缺血時間的延長，葡萄糖及乳酸隨冷保存時間延長而下降，而甘油三酯及丙酮酸則增高，各時間點的比較有統(tǒng)計學差異（均為P＜0.001）。乳酸/丙酮酸的比值下降，沒有統(tǒng)計學差異(P=0.33)。
　　結論：
　　乳酸水平及乳酸/丙酮酸比值與熱缺血時間呈明顯正相關，有望作為移植物熱缺血損傷的預測指標。葡萄糖、甘油三酯、乳酸和丙酮酸與肝冷缺血時間存在相關性，葡萄糖及乳酸與缺血存時間呈負相關，甘油三酯及丙酮酸與冷缺血時間呈正相