SV，Reo-3，MHV，MAd，RCV病毒免疫血清制備及ELISA等檢測方法的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)動物是生命科學(xué)研究中不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制是動物實(shí)驗(yàn)成功重要保證，其中病毒學(xué)檢測是非常重要的內(nèi)容。為進(jìn)一步完善大、小鼠病毒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，本課題選擇SPF級大、小鼠必檢的五種病毒：仙臺病毒(Sendai Virus，SV)、呼腸孤Ⅲ型病毒(Reovirus type3，Reo—3)、小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)、小鼠腺病毒(Mouse Adenovirus，MAd)、大鼠

2、冠狀病毒(Rat Coronaviruses，RCV)，從質(zhì)量控制血清制備著手，并針對仙臺病毒和呼腸孤Ⅲ型病毒做ELISA試劑盒的研制，同時嘗試建立病原學(xué)檢測方法，為實(shí)現(xiàn)一種病原，多種檢測方法以及不同方法比較、豐富檢測資源做出努力，同時為利用病毒表達(dá)抗原、替代抗原等建立更敏感檢測方法提供基礎(chǔ)比對方法體系。 制備多價病毒抗血清，建立標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清。采用分離自動物組織的病毒，選擇SPF級BALB/c小鼠和Wistar大鼠，定期攻毒方

3、式模擬自然感染使其帶毒或患病，待抗體滴度達(dá)到一定要求時，收集血清。本實(shí)驗(yàn)共制備Mouse anti—SV(IFA1：640)18 mL，Mouse anti—Reo—3(IFA1：640)18 mL，Mouse anti—MHV(IFA1：320)25 mL，Mouseanti—MAd(IFA1：320)18 mL，Mouse anti—RCV(IFA1:160)15 mL。制備的抗血清間無交叉反應(yīng)，血清特異性強(qiáng)、重復(fù)性穩(wěn)定、保存質(zhì)量高

4、，可以做為標(biāo)準(zhǔn)化檢測體系中穩(wěn)定可靠的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)血清。 著重建立了SV ELISA體系和Reo—3 ELISA體系。細(xì)胞培養(yǎng)大量擴(kuò)增病毒抗原，并以正常細(xì)胞上清作為對照，所制備的對照血清為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，確定抗原工作濃度和判定標(biāo)準(zhǔn)建立ELISA體系，評價其重復(fù)性，特異性、靈敏度、穩(wěn)定性等指標(biāo)，進(jìn)行病毒EUSA試劑盒的研制，并以IFA、IEA等方法進(jìn)行比對。 SV EUSA抗原和標(biāo)準(zhǔn)化小鼠SV血清最佳工作濃度分別為2.5ug/mL和

5、1：6000，酶標(biāo)二抗工作濃度1:10000；該ELISA檢測體系SV特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)為7.4％，批間變異系數(shù)為4.9％；ELISA檢測靈敏度為1：25600；與Reo—3、MHV、MAd、Vaccinia Virus、POLY均無交叉反應(yīng)；經(jīng)37℃破壞性試驗(yàn)，2d穩(wěn)定性試驗(yàn)相對偏差<20％，均達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求。 Reo—3 ELISA抗原和標(biāo)準(zhǔn)化小鼠Reo—3血清最佳工作濃度分別為5μg/mL和1：2400；該ELI

6、SA檢測體系Reo—3特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)為3.8％，批間變異系數(shù)為4.0％；ELISA檢測靈敏度為1：4400；與SV、MHV、MAd、Vaccinia Virus、POLY均無交叉反應(yīng)。經(jīng)37℃破壞性試驗(yàn)，2d穩(wěn)定性試驗(yàn)相對偏差<27％，均達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求。 建立病原學(xué)RT-PCR檢測方法。提取病毒培養(yǎng)上清或組織來源病毒液RNA，反轉(zhuǎn)錄后優(yōu)化擴(kuò)增條件，擴(kuò)增SV、MHV、Reo—3和RCV獲得相應(yīng)特異性目的條帶。針對IFA

7、方法確定為陽性的SV送檢血清樣本進(jìn)行的檢測中，未獲得特異性擴(kuò)增。 本實(shí)驗(yàn)制備的病毒抗血清特異性強(qiáng)，滴度高，批量穩(wěn)定，可作為長期穩(wěn)定的檢測對照，并為大小鼠病毒檢測體系的標(biāo)準(zhǔn)化打下基礎(chǔ)。而針對SV和Reo—3病毒建立的間接ELISA檢測試劑盒，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好。針對檢測病原的RT-PCR方法在實(shí)際應(yīng)用中，不適宜常規(guī)檢測，但可用于病原跟蹤調(diào)查和探討病原抗原抗體檢出關(guān)系的研究。 本研究批量制備了免疫血清并通過質(zhì)量控