口蹄疫病毒VP3定點(diǎn)突變體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性和免疫血清學(xué)研究.pdf

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種重大動(dòng)物疫病，我國(guó)歷史上發(fā)生和近年來(lái)流行的有O、A和Asia1三個(gè)血清型，其中O型口蹄疫對(duì)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的威脅最大。疫苗免疫是防控本病的重要手段，現(xiàn)有的市售口蹄疫疫苗包括常規(guī)滅活疫苗和合成肽疫苗。但是，前者不利于與口蹄疫病毒自然感染動(dòng)物的鑒別診斷，后者在有新發(fā)外來(lái)病毒株入侵時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)免疫失敗。目前，隨著口蹄疫反向疫苗學(xué)的發(fā)展，借助基因工程手段缺失或沉默口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)表位創(chuàng)制的負(fù)標(biāo)記疫苗有效

2、解決了第一個(gè)瓶頸問(wèn)題;本研究探索性地在口蹄疫病毒外部衣殼蛋白VP3的G-H環(huán)中進(jìn)行靶向改造，旨在為廣譜、多聯(lián)（價(jià)）、正標(biāo)記疫苗的研發(fā)提供借鑒性思路。
　　首先，為了評(píng)估外部衣殼蛋白VP3G-H環(huán)展示外源標(biāo)簽的能力，本研究利用成熟的O型Cathay拓?fù)湫涂谔阋卟《痉聪蜻z傳操作技術(shù)平臺(tái)(pOFS→rHN)，構(gòu)建了兩種HA插入型（第3171-3172位）的基因組全長(zhǎng)cDNA。遺憾的是，未能拯救到基因工程毒。遂將HA、Flag、VSV-G

3、替換性引入該區(qū)段，構(gòu)建了六種外源標(biāo)簽替換型的基因組全長(zhǎng)cDNA。同樣地，也未能獲得基因工程毒，而且，其中一種HA替換型的口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng)cDNA經(jīng)密碼子優(yōu)化后仍無(wú)法獲得基因工程毒。這表明骨架病毒rHN的VP3G-H環(huán)中存在著與口蹄疫病毒感染性相關(guān)的關(guān)鍵性氨基酸。
　　為此，本研究對(duì)照一種HA修飾型質(zhì)粒，對(duì)骨架病毒的基因組全長(zhǎng)感染性cDNA進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了四種突變型質(zhì)粒，同時(shí)，參考C型和SAT2型口蹄疫病毒代表株，構(gòu)建了三種

4、血清型間嵌合型質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染結(jié)果證實(shí)，僅有突變型質(zhì)粒pOFSv3174Y和血清型間嵌合型質(zhì)粒pOFSD3173N+V3174E+N3179C具有感染性，兩種定點(diǎn)突變體分別命名為rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。
　　最后，本研究對(duì)兩種定點(diǎn)突變體與骨架病毒進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定和免疫血清學(xué)比較分析。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，①rHND3173N+V3174E+N3179C定點(diǎn)突變體在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代時(shí)容易引發(fā)假

5、回復(fù)突變和第二位點(diǎn)突變;②rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C細(xì)胞傳代毒均獲得了侵染CHO系列細(xì)胞的能力（非RGD依賴(lài)型受體），③rHN、rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遺傳穩(wěn)定株在BHK-21細(xì)胞上的蝕斑表型、復(fù)制動(dòng)力學(xué)略有差異，但差異不顯著。④與rHN相比，rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遺傳穩(wěn)定株的體內(nèi)/外致病力均有下降，后者更為明顯

6、;⑤與rHN的免疫陽(yáng)性血清相比，rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遺傳穩(wěn)定株的免疫陽(yáng)性血清對(duì)我國(guó)現(xiàn)已分離的O型Mya98和PanAsia-1譜系FMDV的交叉中和能力均有不同程度的改變，且后者的r值均大于05(符合OIE規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，r≥0.3)。
　　上述研究結(jié)果提示，可通過(guò)嘗試性地在空間結(jié)構(gòu)上外露于病毒衣殼表面且靠近口蹄疫病毒抗原位點(diǎn)的莖環(huán)區(qū)進(jìn)行氨基酸殘基的人為修飾，有望針對(duì)性地拓實(shí)口蹄疫疫苗候選株