人肺癌細(xì)胞株中沉默MTA1基因可導(dǎo)致細(xì)胞體外侵襲能力的抑制及相關(guān)microRNA表達(dá)譜的改變.pdf

1、肺癌是一種常見的惡性腫瘤，肺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。隨著人類生活環(huán)境的污染與破壞，人們的不良生活方式等各種因素，肺癌的高發(fā)病率與高死亡率已經(jīng)成為關(guān)注的熱點(diǎn)問題。盡管近來在診斷和治療取得了進(jìn)展，肺癌的預(yù)后仍然很差，其5年生存率一直在9％-14％左右，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者治療效果和導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。
　　 腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，涉及到腫瘤細(xì)胞、機(jī)體、靶組織的相互

2、影響和作用，涉及到一系列腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)或/和功能的異常，最終導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移。因此，探索研究新的基因功能與肺癌轉(zhuǎn)移惡性特征的關(guān)系，對于提升肺癌進(jìn)展相關(guān)分子機(jī)制的了解、設(shè)計(jì)合理的治療藥物及改善肺癌的臨床預(yù)后非常關(guān)鍵。近年來，大量研究表明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MTA家族蛋白對腫瘤轉(zhuǎn)移有著重要影響。
　　 MTA基因家族，最初是在鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌中經(jīng)cDNA庫差異篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)而命名。目前的研究熱點(diǎn)集中在MTA1基因上面。近五年來，MTA1

3、在各種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性被廣泛認(rèn)知。MTA1具有可以抑制或激活腫瘤基因的雙重作用，在腫瘤生物學(xué)上扮演重要角色。在人類腫瘤中有廣泛的過表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有密切的聯(lián)系，但具體的機(jī)制并不清楚。對子宮內(nèi)膜癌、胰腺腫瘤、喉癌等腫瘤組織的分析發(fā)現(xiàn)MTA1mRNA或MTA1蛋白的過度表達(dá)均與腫瘤侵襲和/或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，且在乳腺癌、肝癌、食道癌中，MTA1表達(dá)亦與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，MTA1是一種重要的肺癌相關(guān)基因，其過

4、表達(dá)具有促進(jìn)癌細(xì)胞分裂增殖和侵襲遷移等功能，可能是肺癌細(xì)胞特征性行為表現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)或本質(zhì)原因之一。
　　 microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的一類非編碼小分子單鏈RNA，長度約21-22個(gè)堿基對構(gòu)成，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤進(jìn)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，但迄今對microRNA參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全明確。大量研究顯示同種microRNA在不同類型腫瘤中可通過作用于不同編碼基因，經(jīng)不同的信號通路發(fā)揮不同的作用。因此需要

5、對特定microRNA在特定環(huán)境下的靶基因進(jìn)行更多、更詳盡的研究，為腫瘤的診斷和治療開發(fā)特異性藥物。
　　 為此，本項(xiàng)目擬以體外培養(yǎng)的、來自同一細(xì)胞系(PLA-801)具有相同遺傳背景的人肺癌高低轉(zhuǎn)移株95D和95C為研究對象，采用生物信息學(xué)方法及MTA1基因轉(zhuǎn)染或RNA干擾、microRNA過表達(dá)或抑制、靶基因表達(dá)檢測、細(xì)胞功能分析等技術(shù)手段，結(jié)合肺癌臨床組織樣本分析，研究MTA1基因促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理與其調(diào)節(jié)表達(dá)

6、的microRNA之間的關(guān)系，旨在闡明MTA1促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子靶點(diǎn)，闡明受MTA1調(diào)節(jié)表達(dá)的microRNA的功能。為進(jìn)一步明確肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行有益的探索。
　　 研究目標(biāo)：
　　 研究MTA1基因促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理與其調(diào)節(jié)表達(dá)的microRNA之間的關(guān)系，旨在闡明MTA1促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子靶點(diǎn)，同時(shí)也闡明受MTA1調(diào)節(jié)表達(dá)的microRNA的功能，進(jìn)一步

7、明確肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找可能的抗肺癌轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.慢病毒包裝載體的構(gòu)建
　　 設(shè)計(jì)三段MTA1siRNA及非特異性干擾片段，采用TCTCTTGAA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在5'端和3'端分別加上MluI和ClaI酶切位點(diǎn)，3'端加上TTTTT終止序列，設(shè)計(jì)合成其shRNA的DNAOligo寡核苷酸序列。設(shè)計(jì)合成的上游鏈和下游鏈退火形成寡核苷酸雙鏈，將pLVTHM載體采用內(nèi)切酶ClaI和MluI進(jìn)行

8、雙酶切，獲得粘性末端線性化片段，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳1.5h，膠回收方法獲得線性化片段，用于后續(xù)連接反應(yīng)。將目的片段回收純化后，將回收的pLVTHM線性化片段與MTA1雙鏈oligo進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組慢病毒干擾載體pLVTHM/shMTA1及pLVTHM/vector。從-70℃拿出分裝好的Sta13大腸桿菌感受態(tài)(每管200μl)，冰上溶解，加入10μpLVTHM-shMTA1連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，

9、37℃培養(yǎng)過夜，次日挑取單個(gè)菌落接種到5ml氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，對菌液進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定為陽性者送測序。
　　 2.穩(wěn)定沉默MTA1肺癌細(xì)胞株的構(gòu)建
　　 pLVTHM/shMTA1重組載體及非特異性、空白對照載體構(gòu)建成功后，中量提取質(zhì)粒，并進(jìn)行慢病毒包裝、測定病毒滴度。將含有MTA1-shRNA的慢病毒(pLVTHM/shMTA1)和非特異性干擾片段pLVTHM/vector的慢病毒及空載對照

10、慢病毒(pLVTHM)分別感染高表達(dá)MTA1的95D，次日去除含病毒的培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)基，感染72h后熒光顯微鏡下觀察GFP的發(fā)光情況。由于載體pLVTHM只帶有綠色熒光標(biāo)記(GFP)而不帶抗性標(biāo)記，因而病毒感染后穩(wěn)定細(xì)胞株的建立不能采用常規(guī)的抗生素篩選單克隆的方法。鑒于慢病毒感染效率較高，本研究依據(jù)GFP標(biāo)記，對多克隆細(xì)胞進(jìn)行96孔板有限稀釋，進(jìn)行單克隆細(xì)胞的挑選。選取穩(wěn)定發(fā)光的單克隆細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通

11、過熒光定量PCR鑒定干擾后單克隆細(xì)胞中MTA1的表達(dá)。提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后，通過Westernblot鑒定干擾單克隆細(xì)胞中MTA1在蛋白水平的表達(dá)。通過這兩個(gè)試驗(yàn)，觀察MTA1的沉默效率。
　　 3.CCK-8法檢測MTA1沉默后對肺癌細(xì)胞生長特性的影響
　　 1×103個(gè)指數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞懸液量為200ul，置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7天，每孔加入10ul的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置

12、于培養(yǎng)箱中孵育1h，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的OD值，以相對應(yīng)OD值表示細(xì)胞增殖能力大小。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，取平均值，繪制體外生長曲線。
　　 4.劃痕實(shí)驗(yàn)
　　 將95D/NC，95D/CTL-si，95D/MTA1-si1#3組細(xì)胞分別接種1×105個(gè)細(xì)胞于6孔板，每組細(xì)胞作3個(gè)重復(fù)孔，待細(xì)胞長至約90％匯合時(shí)，用200ul槍頭垂直在培養(yǎng)孔中部輕輕劃過，垂直和水平方向各交錯(cuò)劃3條線，力度以劃落細(xì)胞而不在培養(yǎng)板上留下

13、痕跡為準(zhǔn)。用PBS沖洗干凈脫落的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)孔隨機(jī)選取9個(gè)有劃痕穿過的視野，分別觀察0h，12h，24h時(shí)3組細(xì)胞劃痕處細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)變化，并拍照取樣，應(yīng)用ImageJ軟件測劃痕相對寬度，繪制遷移力量值曲線，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 5.克隆形成試驗(yàn)
　　 取95D/NC，95D/CTL-si，95D/MTA1-si1#3組細(xì)胞對數(shù)期分別接種100個(gè)于六孔板中，每組細(xì)胞作3個(gè)重復(fù)孔，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞

14、分散均勻，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，PBS液洗3次后，置于室溫中空氣干燥;甲醇固定15min，棄甲醇后室溫空氣干燥;用蘇木紫應(yīng)用染液染色15min，流水緩慢洗去染液，室溫空氣干燥后顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期
　　 收取對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞

15、密度約為1-10×105個(gè)/ml，按下述方法進(jìn)行PI染色:收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS離心(800pm，5min)，洗滌細(xì)胞兩次，去除殘留培養(yǎng)基;預(yù)冷的70％乙醇4℃固定過夜。用4°預(yù)冷的PBS離心(800rpm，5min)洗滌2次，加入400μlPBS重懸細(xì)胞，加入RNaseA至終濃度0.5mg/ml，碘化丙啶(PI，10μg/ml)染色30分鐘;避光冰上放置15分鐘，上機(jī)檢測;經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CELLQuest軟件獲

16、取全部數(shù)據(jù);全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用單因素方差分析對三種細(xì)胞中各期細(xì)胞的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 7.Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
　　 本實(shí)驗(yàn)所用Transwell小室購自美國Corning公司，小室孔徑為8.0μm。取對數(shù)期的生長細(xì)胞，PBS洗1-2遍，胰酶消化后吹打均勻，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1-10×105，加200μl細(xì)胞懸液于內(nèi)室

17、，然后加500μl含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基于下室，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失，若出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)12h。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細(xì)胞，甲醇固定15min，棄甲醇后室溫空氣干燥，用蘇木紫染液染色15min，用去離子水輕輕地沖洗數(shù)次，室溫空氣中風(fēng)干。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。
　　 8

18、.Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)
　　 本實(shí)驗(yàn)所用Transwell小室購自美國Corning公司，小室孔徑為8.0μm。實(shí)驗(yàn)用的人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原。鋪設(shè)基底膠前將槍頭，Transwell小室，等放于4°冰箱預(yù)冷后，用50mg/LMatrigel1:10稀釋液均勻鋪設(shè)在Transwell小室底部膜的上室面，置于37°培養(yǎng)箱中孵育1-2h，使基質(zhì)膠凝固成膜后，吸出小室中殘余液體，

19、每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。取對數(shù)期的生長細(xì)胞，胰酶消化后吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×105/ml。加200μl細(xì)胞懸液于內(nèi)室，然后加500μl含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基于下室，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失，若出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)12h

20、。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細(xì)胞，甲醇固定15min，棄甲醇后室溫空氣干燥，用蘇木紫染液染色15min，用去離子水輕輕地沖洗數(shù)次，室溫空氣中風(fēng)干。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。運(yùn)用One-WAYANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間的多重比較方差齊用LSD進(jìn)行多重比較，方差不齊用Dunn

21、ett'sT3進(jìn)行多重比較;細(xì)胞體外生長實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了重組慢病毒干擾載體pLVTHM/shMTA1，非特異片段干擾慢病毒載pLVTHM/vector，空白對照慢病毒載體(pLVTHM)，并成功轉(zhuǎn)入高表達(dá)MTA1的人肺癌95D細(xì)胞中，構(gòu)建了干擾效率較高的穩(wěn)定沉默MTA1的人肺癌細(xì)胞株、非特異性干擾及空白對照細(xì)胞株。
　　 2.沉默M

22、TA1基因后，人肺癌細(xì)胞95D的體外增殖能力沒有明顯變化，而細(xì)胞的遷移及侵襲能力有明顯的降低。穩(wěn)定沉默MTA1的細(xì)胞株95D/MTA1-si1#的體外增殖能力與空白對照95/NC及非特異性干擾細(xì)胞株95D/CTL-si相比沒有顯著差異(F=3.064，P=0.057)，且細(xì)胞組別與天數(shù)之間無交互效應(yīng)(F=1.172，P=0.334)，說明MTA1基因沉默后細(xì)胞增殖能力未有明顯改變，三組細(xì)胞增殖速度隨時(shí)間變化趨勢相同。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示

23、MTA1基因沉默后細(xì)胞的克隆形成能力未有明顯改變(F=3.085，P=0.095)。細(xì)胞周期試驗(yàn)顯示，MTA1沉默后的肺癌細(xì)胞95D/MTA1-si1#與空白對照細(xì)胞株95/NC，及非特異性干擾細(xì)胞株95D/CTL-si相比，G0/G1(F=0.998,P=0.423);G2/M期(F=0.998,P=0.315)期;S(F=3.778，P=0.087)期比例改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，MTA1沉默后的肺癌細(xì)

24、胞95D/MTA1-si1#遷移距離明顯小于空白對照組及非特異性干擾組細(xì)胞(F=139.429，P＜0.01)，析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，細(xì)胞組間與時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(F=20.703，P＜0.01)，說明隨著時(shí)間的變化，兩組細(xì)胞體外遷移距離的變化趨勢不同，MTA1沉默后95D細(xì)胞的遷移能力有所減弱。Transwell小室檢測細(xì)胞體外遷移能力的變化，結(jié)果顯示，MTA1穩(wěn)定沉默后的細(xì)胞株95D/MTA1-si1#的遷移能力明顯弱于空白

25、對照細(xì)胞株95/NC，及非特異性干擾細(xì)胞株95D/CTL-si(F=333.902，P＜0.01)。Transwell小室分析細(xì)胞體外侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照細(xì)胞株95/NC，及非特異性干擾細(xì)胞株95D/CTL-si相比，MTA1穩(wěn)定沉默后的細(xì)胞株95D/MTA1-si1#穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)顯著減少，其體外侵襲能力顯著降低(F=173.561，P＜0.01)。綜合以上結(jié)果表明，沉默MTA1基因抑制了肺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能

26、力，但對細(xì)胞的增殖能力沒有明顯影響，亦并未導(dǎo)致細(xì)胞周期的改變。進(jìn)一步驗(yàn)證了MTA1在肺癌中的生物學(xué)功能。
　　 3.沉默MTA1基因后，用基因芯片檢測到肺癌細(xì)胞40種microRNA的表達(dá)譜發(fā)生改變，其中6種microRNA的表達(dá)差異倍數(shù)＞2，分別是分別是miR103、miR125b、miR194、miR210、miR500、miR744。其中，MTA1基因沉默后，表細(xì)胞株中miR125b、miR194的表達(dá)量顯著上升，miR2

27、10、miR500、miR103的表達(dá)量顯著降低，miR-744的表達(dá)量沒有明顯改變。
　　 結(jié)論:
　　 1.MTA1基因干擾后，對肺癌細(xì)胞95D的體外增殖能力沒有明顯影響。
　　 2.MTA1基因干擾后，肺癌細(xì)胞95D的體外遷移和侵襲能力有顯著降低。
　　 3.MTA1基因干擾后，肺癌細(xì)胞95D的體外遷移和侵襲能力有顯著降低。
　　 4.在分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MTA1干擾載體，非特異性干擾載體和空載

28、體的人肺癌細(xì)胞中用基因芯片檢測了發(fā)現(xiàn)了40種microRNA的表達(dá)譜發(fā)生改變，其中6種microRNA的表達(dá)差異倍數(shù)＞2，分別是分別是miR103、miR125b、miR194、miR210、miR500、miR744.
　　 5.經(jīng)過Real-timePCR驗(yàn)證，MTA1基因沉默后，細(xì)胞株中miR125b、miR194的表達(dá)量顯著上升，miR210、miR500、miR103的表達(dá)量顯著降低，miR-744的表達(dá)量沒有明顯改變