非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞株目的microRNA的篩選及l(fā)et-7a體外調(diào)控95D細(xì)胞侵襲能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、目的microRNA的篩選和let-7a在肺癌組織中的表達(dá)
　　 目的：篩選非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞株的目的microRNA。
　　 方法：通過對(duì)CpG ODN刺激前后的非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞株進(jìn)行microRNA的基因芯片檢測(cè)，篩選出變化幅度最大的microRNA。用Real-time PCR方法檢測(cè)和驗(yàn)證目的microRNA在20例非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織和正常肺組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：經(jīng)

2、CpG ODN刺激后，絕大部分microRNAs表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，其中l(wèi)et-7a的下調(diào)幅度最大(達(dá)6.9倍)。70％肺癌組織標(biāo)本(14/20例)中l(wèi)et-7a的表達(dá)低于正常肺組織，肺癌組織中l(wèi)et-7a的整體表達(dá)明顯低于正常肺組織，僅為后者的60％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：確定let-7a為非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞株的目的microRNA，并進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分、let-7a慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

3、r>　　 目的：構(gòu)建let-7a慢病毒載體并進(jìn)行鑒定。
　　 方法：分別構(gòu)建let-7a mimics和let-7a inhibitor慢病毒載體并包裝。測(cè)定慢病毒滴度，并進(jìn)行靶細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：慢病毒測(cè)序正確。當(dāng)慢病毒滴度為1×108TU/ml時(shí)，侵染靶細(xì)胞(95D細(xì)胞)的效率可達(dá)到95％左右，符合實(shí)驗(yàn)要求。RT-PCR檢測(cè)證實(shí)，轉(zhuǎn)染let-7a mimics慢病毒載體的95D細(xì)胞表達(dá)高水平的let-7a，

4、而轉(zhuǎn)染let-7a inhibitor慢病毒載體的95D細(xì)胞表達(dá)低水平的let-7a，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：let-7a慢病毒載體構(gòu)建成功。
　　 第三部分、let-7a對(duì)非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞株增殖和侵襲能力的影響及分子機(jī)制探討
　　 目的：觀察let-7a對(duì)95D細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，并探討可能的分子學(xué)機(jī)制。
　　 方法：將95D細(xì)胞株分為let-7a過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染let-7a m

5、imics慢病毒載體)和let-7a抑制組(轉(zhuǎn)染let-7a inhibitor慢病毒載體)。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察和比較let-7a對(duì)上述兩組細(xì)胞增殖與侵襲能力的影響。應(yīng)用Real-time PCR及Western blot法分別檢測(cè)和比較上述兩組細(xì)胞在mRNA和蛋白水平表達(dá)KRAS和HMGA2基因的情況。
　　 結(jié)果：let-7a過表達(dá)組的細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯低于let-7a抑制組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義