深低溫凍存復(fù)蘇的外周血干細(xì)胞中ROS水平與歸巢粘附分子表達(dá)之間關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)是干細(xì)胞的一種,其主要功能是通過不斷分化產(chǎn)生各系造血祖細(xì)胞,為血液系統(tǒng)提供新生細(xì)胞來源;同時(shí)又能自我更新維持自身數(shù)量不變,從而長(zhǎng)期維持機(jī)體的正常造血機(jī)能,這種分化及我更新的能力是外周血干細(xì)胞移植(peripheralblood stem cell transplantation PBSCT)的生物學(xué)基礎(chǔ)。PBSCT是治療急性白血病和對(duì)化療治療敏感

2、的實(shí)體瘤有效的方法,它是利用化療和動(dòng)員劑后外周血干細(xì)胞(peripheral blood stem cells,PBSC)-過性增高的機(jī)會(huì)進(jìn)行采集、分離、低溫凍存PBSC,將其復(fù)蘇后回輸給患者以重建造血功能。在PBSCT過程中,凍存技術(shù)及PBSC凍存后的歸巢能力決定著PBSCT的成敗。
　　 HSC“歸巢”是指HSC隨血液循環(huán)最初出現(xiàn)在骨髓、脾、肝、甲狀腺等多個(gè)器官,而后特異性地停留在骨髓干細(xì)胞龕。研究表明造血干細(xì)胞歸巢的過程是

3、多步驟粘附及遷移的過程,目前多認(rèn)為P-、E-選擇素,VLA-4及其配體血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1),CD44,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)和其特異性受體CXCR4等在HSC歸巢中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平過高發(fā)生氧化應(yīng)激,可導(dǎo)致歸巢重要粘附分子P-selectin、VLA4、VLA5、CXCR4、CD44等表達(dá)異常,進(jìn)而影響HSC的歸巢能力,ROS是指細(xì)胞利用氧進(jìn)

4、行能量代謝的副產(chǎn)物,其主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)經(jīng)程控降溫液氮保存前后PBSC的ROS水平及歸巢分子的表達(dá),分析二者之間的相關(guān)性,評(píng)價(jià)深低溫凍存、復(fù)蘇對(duì)外周血干細(xì)胞歸巢能力的影響及原因,為進(jìn)一步改善冷凍保存及復(fù)蘇的條件,保護(hù)PBSC免于氧化應(yīng)激損傷,維持其良好的生物學(xué)功能提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、采集、冷凍保存及復(fù)蘇PBSC
　　 外周血干細(xì)胞來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬

5、第一醫(yī)院血液科血液系統(tǒng)腫瘤患者,患者經(jīng)化療及重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rHu-GCF)動(dòng)員后應(yīng)用COBESpectra(GambroBCT,JSA)血細(xì)胞分離機(jī)應(yīng)用PBSC分離程序采集外周血1～2次,得到含有PBSC的血液,進(jìn)行常規(guī)臨床凍存時(shí)留取相關(guān)功能檢測(cè)樣本,經(jīng)功能檢測(cè)后廢棄樣本。將含有PBSC的血樣在無菌室超凈臺(tái)內(nèi)用Ficoll分離出PBSC后,分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中添加由自體血漿、ACD抗凝劑、二甲基亞砜(DMSO)按

6、7:2:1比例組成的冷凍保護(hù)劑,置HBL-96型程序降溫儀中進(jìn)行降溫,達(dá)到-86℃保持10min后,取出冷凍標(biāo)本,迅速置入-196℃液氮罐中凍存1、3、6、9、12個(gè)月后,取出標(biāo)本放入37℃水浴箱中快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞中不添加冷凍保護(hù)劑及經(jīng)程控降溫冷凍保存。
　　 二、觀察檢測(cè)指標(biāo)
　　 分別觀察檢測(cè)復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組PBSC以下指標(biāo):用ABXMicros60血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液測(cè)定PBSC

7、臺(tái)盼藍(lán)拒染率;37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)14天后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)CFU-GM集落數(shù);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;流式檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD133以及歸巢相關(guān)分子VLA4、CXCR4、CD44的表達(dá);研究ROS水平與歸巢分子的表達(dá)之間的相關(guān)性,評(píng)價(jià)凍存、復(fù)蘇PBSC過程中ROS水平對(duì)HSC功能,特別是歸巢功能相關(guān)粘附分子表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),不同凍存時(shí)間的數(shù)據(jù)與凍存前數(shù)

8、據(jù)比較時(shí)采用方差分析,分析ROS水平與歸巢分子表達(dá)之間相關(guān)性時(shí)采用相關(guān)分析,P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.PBSC經(jīng)液氮深低溫保存后,臺(tái)盼藍(lán)拒染率隨凍存時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低,PBSC凍存1個(gè)月的臺(tái)盼藍(lán)拒染率與凍存前比較無顯著性差異(P>0.05);凍存3、6、9、12個(gè)月與凍前比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05);冷凍保存半年后臺(tái)盼藍(lán)拒染率降至80%-90%,一年后的臺(tái)盼藍(lán)拒染率為70%左右

9、。
　　 2.冷凍保存的PBSC體外生成CFU-GM的能力不及冷凍保存前的標(biāo)本,并隨凍存時(shí)間延長(zhǎng)集落生成能力存在下降趨勢(shì),凍存1、3、6個(gè)月與凍存前比較無顯著性差異(P>0.05),凍存9、12個(gè)月與凍前比較具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.PBSC經(jīng)液氮深低溫保存后,干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD34、CD133及歸巢相關(guān)分子CD44、VLA4、CXCR4占淋巴細(xì)胞百分率隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)有所下降,凍存1、3、6、9

10、個(gè)月與凍存前比較無顯著差異(P>0.05),冷凍保存一年后與凍存前相比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4.隨著冷凍保存時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高,凍存1、3個(gè)月的外周血干細(xì)胞內(nèi)ROS水平與凍存前比較無顯著性差異(P>0.05),凍存6、9、12個(gè)月后細(xì)胞內(nèi)ROS水平與凍前比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 5.PBSC內(nèi)ROS水平與細(xì)胞CD34+VLA4+、CD34+CXCR4+、CD34+CD4

11、4+雙陽性表達(dá)率之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.503、-0.457、-0.465(均P<0.05),ROS水平與歸巢分子的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。除此之外,ROS與臺(tái)盼藍(lán)拒染率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為-0.863(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高后導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。ROS與CFU-GM之間相關(guān)系數(shù)為-0.329(P>0.05),提示ROS與形成CFU-GM能力之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,但相關(guān)關(guān)系并不密切。
　　 結(jié)論：
　　 1.外周