靶向毀損觸液核對(duì)切口痛大鼠不同時(shí)間點(diǎn)痛行為及腦脊液ENK含量的影響.pdf

1、目的：通過創(chuàng)新應(yīng)用霍亂毒素亞單位B一皂草素交聯(lián)復(fù)合物(CB-SAP)靶向毀損觸液核神經(jīng)元技術(shù)、特異性地毀損觸液核，建立缺失觸液核的動(dòng)物模型，考察觸液核對(duì)切口痛大鼠行為及其腦脊液中ENK含量的影響，為觸液核經(jīng)腦一腦脊液環(huán)路及ENK參與痛覺調(diào)制提供形態(tài)與物質(zhì)依據(jù)。
　　方法：1.缺失觸液核動(dòng)物模型的建立雄性SD大鼠(250±50g)，隨機(jī)分為CB-SAP組:(側(cè)腦室注射靶向毀損劑CB-SAP，500ng/3ul); CB組:(側(cè)腦室注

2、射毀損劑耦合載體，也是觸液核神經(jīng)元特異性標(biāo)記物CB，500ng/3ul); CB-SAP組又分為毀損1、3、5、7、10天等5個(gè)亞組。CB組于注射后1天處死大鼠，CB-SAP組分別于注射后1、3、5、7、10天處死大鼠，取觸液核所在段腦組織，冰凍切片，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)標(biāo)記技術(shù)與激光共聚焦顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，觀察術(shù)后觸液核內(nèi)CB陽(yáng)性神經(jīng)元，即觸液核神經(jīng)元?dú)埩羟闆r。Image-Pro Plus6.0圖像軟件比較各時(shí)間點(diǎn)的毀損率，以確認(rèn)觸液核被

3、完全毀損的時(shí)間點(diǎn)，建立缺失觸液核的動(dòng)物模型。
　　2.缺失觸液核切口痛大鼠痛行為的檢測(cè)雄性SD大鼠，隨機(jī)分為CB-SAP組和PBS組。CB-SAP組按1相同方法側(cè)腦室注射靶向毀損劑CB-SAP;PBS組用PBS(CB-SAP的溶媒)代替CB-SAP側(cè)腦室注射。參照1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以觸液核被完全毀損的時(shí)間點(diǎn)作為大鼠痛行為的觀測(cè)起點(diǎn)。于此時(shí)間點(diǎn)，按Brennan法[1]進(jìn)一步施加切口痛刺激，檢測(cè)兩組大鼠切口痛術(shù)前及術(shù)后4、8、16、24

4、小時(shí)的機(jī)械縮足閾值(Mechanical withdraw threshold,MWT)。
　　3.缺失觸液核切口痛大鼠腦脊液中ENK檢測(cè)雄性SD大鼠，隨機(jī)分為CB-SAP組和PBS組，每組又分為術(shù)前及術(shù)后4、8、16、24小時(shí)等五個(gè)亞組。CB-SAP組和PBS組的處理同方法2，抽取兩組大鼠切口痛術(shù)前及術(shù)后4、8、16、24小時(shí)的腦脊液，用ELISA法檢測(cè)腦脊液中ENK的含量。
　　結(jié)果：1.缺失觸液核動(dòng)物模型的確立

5、　　CB組:觸液核CB陽(yáng)性神經(jīng)元恒定出現(xiàn)在腦干的特定節(jié)段，高度集中，計(jì)數(shù)恒定:277±14。CB-SAP組:側(cè)腦室引入CB-SAP后第1天，大部分觸液核CB陽(yáng)性神經(jīng)元輪廓基本清晰，但少量CB陽(yáng)性神經(jīng)元胞體和胞核體積縮小，觸液核CB陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)為242±11，與CB組相比，約88％的CB陽(yáng)性神經(jīng)元?dú)埩?，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨著天數(shù)的增加，觸液核CB陽(yáng)性神經(jīng)元缺失量越來(lái)越多;第7天未觀測(cè)到完整的CB陽(yáng)性神經(jīng)元，全部的觸液核CB

6、陽(yáng)性神經(jīng)元缺失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);第10天，仍未觀測(cè)到CB陽(yáng)性神經(jīng)元。
　　術(shù)前:CB-SAP組大鼠的MWT/TWL基礎(chǔ)值為14.22±3.83g/10.33±0.79s，低于PBS組的21.31±3.23g/15.35±0.75s(P＜0.01)。
　　術(shù)后:CB-SAP組術(shù)后4、8、16、24小時(shí)的MWT/TWL值（4.12±1.26g/3.71±0.82s，5.37±1.48g/4.18±0.59s，6

7、.77±1.41g/5.77±0.72s，6.77±1.64g/6.19±0.74s）均低于PBS組（7.63±1.40g/5.17±1.01s,9.95±1.83/9.36±1.34s,10.30±2.19g/10.10±1.21s,11.30±1.76g/11.05±0.88s），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。PBS組的MWT/TWL值在術(shù)后4小時(shí)降至最低值，然后逐漸恢復(fù)，與術(shù)后4小時(shí)相比，術(shù)后8、16、24小時(shí)的的M

8、WT/TWL值，均出現(xiàn)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); CB-SAP組的MWT/TWL值在術(shù)后4小時(shí)降至最低值，但與術(shù)后4小時(shí)相比，術(shù)后8小時(shí)的MWT/TW值未出現(xiàn)顯著性升高(P＞0.05)，至術(shù)后16、24小時(shí)才出現(xiàn)顯著性增高(P＜0.05或0.01)。
　　3.缺失觸液核切口痛大鼠腦脊液EN含量的改變
　　術(shù)前CB-SAP組的ENK含量的基礎(chǔ)值為218.54±15.57 pg/ml，低于PBS組的256.99

9、±16.16pg/ml(P＜0.01)。術(shù)后PBS組和CB-SAP組大鼠腦脊液中ENK的含量都在術(shù)后4小時(shí)達(dá)到峰值，術(shù)后24小時(shí)達(dá)最低。術(shù)后4、8、16、24小時(shí)，CB-SAP組的ENK含量為分別為253.58±23.08pg/ml，242.55±19.73pg/ml，189.61±16.16pg/ml，108.22±10.65pg/ml低于CB組的291.53±24.70 pg/ml，273.51±21.82 pg/ml，210.82

10、±16.89 pg/ml，149.18±10.3 pg/ml差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。
　　結(jié)論：1.側(cè)腦室引入CB-SAP后，隨著時(shí)間的推移觸液核毀損程度逐漸增高，至第7天觸液核被完全毀損，此時(shí)間點(diǎn)為缺失觸液核動(dòng)物模型建立成功的時(shí)間點(diǎn)。2.觸液核缺失大鼠的MWT/TWL在術(shù)前及切口痛術(shù)后均顯著性降低，提示觸液核在生理狀態(tài)下及急性術(shù)后痛過程中均參與了痛覺調(diào)制，且主要發(fā)揮痛覺抑制作用。3.觸液核缺失大鼠腦脊液中EN