鮑（Haliotis diversicolor supertexta）核轉(zhuǎn)錄因子Ab-Rel的功能與特性分析及分子檢測(cè)方法的建立.pdf

1、Rel/NF-κB是一族重要的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其參與調(diào)控免疫細(xì)胞活化、胚胎發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等多種細(xì)胞生理活動(dòng)。研究表明NF-κB過(guò)度活化與炎癥、腫瘤、病毒感染等免疫及病理過(guò)程有非常密切的關(guān)系。在高等哺乳動(dòng)物，Rel/NF-κB作為免疫信號(hào)傳導(dǎo)因子得到了較深入的研究。新藥研發(fā)領(lǐng)域中，NF-κB信號(hào)通路也已成為了重要的靶點(diǎn)。本論文包括基礎(chǔ)理論研究和新應(yīng)用技術(shù)研究?jī)刹糠帧Ｔ诨A(chǔ)理論研究方面，最主要?jiǎng)?chuàng)新性成果是(Ⅰ)在國(guó)際上第一次克

2、隆了腹足動(dòng)物九孔鮑H diversicolor supertexta核轉(zhuǎn)錄因子(Ab-Rel)基因，測(cè)定了該基因的全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列，確定了Ab-Rel與同源蛋白的分子進(jìn)化關(guān)系；(Ⅱ)對(duì)Ab-Rel兩個(gè)不同功能區(qū)進(jìn)行了重組表達(dá)、蛋白純化、功能分析與抗體制備，通過(guò)試驗(yàn)證明了Ab-Rel與Rel/NF-κB蛋白家族在功能上的相似性，確定了貝類NF-κB蛋白的分子結(jié)構(gòu)模式；(Ⅲ)對(duì)Ab-Rel進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)、蛋白活性等功能分析，揭示了貝類

3、NF-κB在免疫反應(yīng)中的激活機(jī)理，用實(shí)驗(yàn)證明了NF-κB信號(hào)通路在貝類中的功能保守性：(Ⅳ)利用桿狀病毒．昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了鮑核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，對(duì)Ab-Rel在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，并對(duì)其核定位信號(hào)進(jìn)行了功能鑒定。所有試驗(yàn)結(jié)果為低等無(wú)脊椎動(dòng)物天然免疫防御系統(tǒng)的研究以及探索NF-κB信號(hào)通路的進(jìn)化起源提供了基礎(chǔ)。在新應(yīng)用技術(shù)研究方面，建立了(Ⅰ)雙抗體間接ELISA和(Ⅱ)磁捕獲等分離檢測(cè)NF-κB蛋白的新技術(shù)。雙抗體間接ELIS

4、A技術(shù)是利用兩個(gè)分別針對(duì)Rel蛋白不同分子結(jié)構(gòu)域的抗體，對(duì)體內(nèi)NF-κB蛋白進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)要比普通的ELISA靈敏，更適用于檢測(cè)表達(dá)量較低，如轉(zhuǎn)錄因子之類的蛋白。我們建立的用于分離NF-κB蛋白的磁捕獲技術(shù)是以磁珠-DNA-蛋白質(zhì)親和為基礎(chǔ)的分離技術(shù)，因?yàn)橹挥芯哂谢钚缘腘F-κB才能被磁珠捕獲，所以該技術(shù)不僅能用于分離NF-κB，同時(shí)還能對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)。磁捕獲NF-κB技術(shù)操作簡(jiǎn)單，樣品受外力影響小，為研究蛋白互作以及藥物篩選提供了

5、一條新的途徑。 主要結(jié)果包括下列部分： 1．鮑核轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)cDNA的克隆與序列分析 根據(jù)Rel蛋白的結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)了寡聚核苷酸引物，利用3′，5′cDNA未端快速擴(kuò)增技術(shù)(3′，5′RACE)獲得了鮑核轉(zhuǎn)錄因子(Ab-Rel)的全長(zhǎng)cDNA序列。該cDNA全長(zhǎng)1943bp，具有一個(gè)1752 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼大小為584個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)Ab-Rel核酸和氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果

6、表明，鮑核轉(zhuǎn)錄因子Ab-Rel具有Rel蛋白家族的主要特征，如DNA結(jié)合基序RGLRFRYECE，核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)EEKRKR和位于NLS上游25個(gè)氨基酸的磷酸化位點(diǎn)RRPS。在以鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，Ab-Rel與昆蟲(chóng)Dorsal類Rel蛋白分在同一個(gè)亞群中，并都?xì)w屬于羧基端具有轉(zhuǎn)錄激活域(TD)的Rel蛋白家族。 2．Ab-Rel的原核表達(dá)，蛋白活性分析與鮑NF

7、-κB晰結(jié)構(gòu)的鑒定 根據(jù)Ab-Rel特殊的蛋白結(jié)構(gòu)分別構(gòu)建了九孔鮑Ab-Rel的Rel同源區(qū)(RHD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TD)的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)和純化，并制備了對(duì)Ab-Rel RHD和TD特異的兩個(gè)多克隆抗體。EMSA結(jié)果表明重組Ab-Rel RHD蛋白具有特異的DNA結(jié)合能力，從蛋白功能上證實(shí)了Ab-Rel與其它Rel家族成員的相似性。以獲得的兩個(gè)抗體進(jìn)行Western印跡分析了鮑NF-κB蛋白的分子結(jié)構(gòu)，證

8、實(shí)了Ab-Rel是鮑NF-κB蛋白的一個(gè)大亞基，進(jìn)而從分子結(jié)構(gòu)上驗(yàn)證了NF-κB蛋白在腹足動(dòng)物．鮑與高等動(dòng)物之間的相似性。 3．Ab-Rel的表達(dá)分析 通過(guò)半定量RT-PCR．和Norther雜交試驗(yàn)檢測(cè)不同組織中Ab-Rel mRNA的含量發(fā)現(xiàn)，Ab-Rel在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，表現(xiàn)了其功能的多樣性。但在血淋巴細(xì)胞中．Ab-Rel轉(zhuǎn)錄子的含量相對(duì)較多，表明Ab-Rel在鮑免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極的作用。 4．Ab

9、-Rel在免疫反應(yīng)中的功能與機(jī)理 半定量RT-PCR、Real-time熒光定量PCR、Norther雜交和EMSA的結(jié)果顯示，大腸桿菌脂多糖(LPS)不能刺激鮑血淋巴細(xì)胞中Ab-Rel的表達(dá)，但可以使血淋巴細(xì)胞中NF-κB的DNA結(jié)合活性增加，表明鮑核轉(zhuǎn)錄因子Ab-Rel在免疫反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用，而其功能的激活發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后。試驗(yàn)結(jié)果證明了NF-κB在鮑免疫反應(yīng)中的作用，從而表明NF-κB信號(hào)通路在腹足類動(dòng)物中的保守性。

10、 5．Ab-Rel在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)與亞細(xì)胞定位 利用Bac to Bac桿狀病毒．昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Ab-Rel基因進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)與綠色熒光蛋白(EGFP)相融合，對(duì)Ab-Rel在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，鮑Ab-Rel基因能在昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)，EGFP-Ab-Rel的融合蛋白定位于細(xì)胞核中。 6．雙抗體間接ELISA檢測(cè)鮑NF-κB 利用兩個(gè)抗體對(duì)鮑NF-κB進(jìn)行ELISA檢測(cè)，與只用一個(gè)抗體的

11、間接ELISA方法相比，該技術(shù)得利于抗體與抗原間有更多的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)加入酶標(biāo)二抗和顯色底物時(shí)，反應(yīng)信號(hào)將會(huì)成倍放大。這種利用雙抗體與二抗聯(lián)用的間接ELISA方法更為靈敏，且操作簡(jiǎn)單，省時(shí)、省力，尤其適用于檢測(cè)如NF-κB這樣表達(dá)量較低的細(xì)胞因子。以此方法從蛋白水平上證明了Ab-Rel存在于鮑不同組織中，但血淋巴細(xì)胞中Ab-Rel蛋白的含量相對(duì)較多，進(jìn)一步說(shuō)明Ab-Rel蛋白在鮑免疫反應(yīng)中的作用。 7．磁捕獲技術(shù)在NF-κB分離與

12、檢測(cè)中的應(yīng)用 本試驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上提出一種新的磁捕獲技術(shù)方案，用于分離和檢測(cè)該DNA結(jié)合蛋白。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，我們成功地從鮑血細(xì)胞蛋白中分離出了Ab-Rel蛋白。為了進(jìn)一步證明該方法的實(shí)用性，我們對(duì)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的重組Ab-Rel蛋白進(jìn)行分離，結(jié)果表明磁捕獲技術(shù)不僅能有效地分離內(nèi)源性NF-κB，而且對(duì)體外重組的NF-κB蛋白同樣有效。因?yàn)橹挥芯逥NA結(jié)合活性的蛋白才能被捕獲分離，所以磁捕獲技術(shù)在分離蛋白的同時(shí)，還可以鑒定