雜色鮑(Haliotis diversicolor)響應(yīng)細(xì)菌攻毒血淋巴細(xì)胞差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、鮑以其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在民間一直被認(rèn)為是與魚(yú)翅、燕窩齊名的營(yíng)養(yǎng)食品。養(yǎng)殖鮑市場(chǎng)價(jià)格高且穩(wěn)定，銷(xiāo)路暢通，利潤(rùn)空間大，深受水產(chǎn)養(yǎng)殖戶(hù)的歡迎，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種。雜色鮑(Haliotis diversicolor Reeve，1846)隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)，腹足綱，前鰓亞綱，原始腹足目，鮑科，是我國(guó)南方鮑種，因其生長(zhǎng)迅速，一直在南方沿海海域得到廣泛的養(yǎng)殖。但近年來(lái)由于養(yǎng)殖海域水質(zhì)影響及養(yǎng)殖鮑種自身退化，使得人工養(yǎng)殖雜色鮑抗病力低，時(shí)有疫病

2、發(fā)生，給養(yǎng)鮑業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋求免疫防治是保障鮑養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要措施，但迄今有關(guān)鮑免疫機(jī)制的研究報(bào)道較少。本項(xiàng)研究應(yīng)用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)篩選細(xì)菌攻毒雜色鮑免疫相關(guān)基因，為深入探討鮑抗細(xì)菌感染免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 1.成功構(gòu)建細(xì)菌攻毒雜色鮑血淋巴細(xì)胞SSH cDNA文庫(kù)血淋巴細(xì)胞是鮑免疫系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，本研究以雌性雜色鮑為對(duì)象，以副溶血弧菌(Vibrioparahaemeolyticus)、大腸桿菌(

3、Escherichia coli)、溶壁微球菌(Micrococcuslsodeikticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)五種細(xì)菌混懸液為攻毒菌，利用SSH技術(shù)，成功構(gòu)建細(xì)菌攻毒雜色鮑血淋巴細(xì)胞SSH cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)容量為1.37×106 cfu，重組效率為98.18％。 2.克隆獲得111個(gè)雜色鮑血淋巴細(xì)胞表達(dá)基因隨

4、機(jī)測(cè)序435個(gè)重組子，經(jīng)序列分析和拼接，總計(jì)克隆獲得111個(gè)雜色鮑血淋巴細(xì)胞表達(dá)基因。利用 AmiGO基因本體釋義工具，將其分為11個(gè)基因群，11個(gè)基因(9.9％)參與細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程；8個(gè)基因(7.2％)參與產(chǎn)生前體代謝物和能量的生物學(xué)過(guò)程；5個(gè)基因(4.5％)參與異生質(zhì)代謝等其他細(xì)胞代謝過(guò)程；10個(gè)基因(9.0％)參與細(xì)胞組分生物合成與裝配過(guò)程；6個(gè)基因(5.4％)參與機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)；8個(gè)基因(7.2％)參與生物調(diào)控：8個(gè)基因(7.

5、2％)參與免疫系統(tǒng)過(guò)程；8個(gè)基因(7.2％)參與應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程；4個(gè)基因(3.6％)分別參與不同的生物學(xué)過(guò)程被合為一個(gè)其他功能基因群；40個(gè)基因(36.0％)屬于完全未知功能的基因；3個(gè)基因(2.7％)是rRNA基因。BLAST同源序列搜索分析發(fā)現(xiàn)25個(gè)基因(22.52％)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到來(lái)源于腹足綱動(dòng)物的同源基因信息，其他86個(gè)基因(77.48％)均是首次在腹足綱動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。 3.確定了52個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因利用半定

6、量PCR和real—time PCR兩種基因差異表達(dá)分析方法共同證實(shí)52個(gè)基因在細(xì)菌攻毒36—40 h的雜色鮑血淋巴細(xì)胞中表現(xiàn)不同程度的差異表達(dá)。其中47個(gè)基因(42.34％)在細(xì)菌攻毒血淋巴細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，5個(gè)基因(4.5％)在生理鹽水對(duì)照組上調(diào)表達(dá)。 4.擴(kuò)增獲得86個(gè)基因的特異基因組DNA片段通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA片段和 BLASTn同源搜索證實(shí)所克隆的雜色鮑血淋巴細(xì)胞表達(dá)基因無(wú)細(xì)菌基因組DNA污染。86個(gè)目的基因可擴(kuò)

7、增出特異基因組DNA片段，其中46個(gè)基因的基因組DNA在擴(kuò)增引物之間無(wú)內(nèi)含子序列；40個(gè)基因的基因組DNA序列在擴(kuò)增引物之間存在內(nèi)含子。通過(guò)Southern blotting和DNA測(cè)序證實(shí)β—thymosin基因(Thym—β)的基因組DNA序列至少含有兩個(gè)基因組拷貝，其中一個(gè)基因拷貝不含內(nèi)含子，另一個(gè)基因拷貝含有兩個(gè)內(nèi)含子，第一內(nèi)含子477 bp，第二內(nèi)含子2818bp。 5.揭示了16個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列利用SMART

8、技術(shù)和游離PCR、錨定PCR原理，較為經(jīng)濟(jì)的批量擴(kuò)增克隆了16個(gè)雜色鮑血淋巴細(xì)胞表達(dá)基因全長(zhǎng)cDNA序列，其中GlSTrs、Profilin、TIMp、PreP2、Thym—β、Ferritin、Calp、Hypo等8個(gè)基因是在細(xì)菌攻毒36—40 h雜色鮑血淋巴細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)基因。 6.分析了14個(gè)基因在鮑體內(nèi)的差異表達(dá)特性利用半定量PCR和熒光定量PCR方法分析GlSTrs、Thym—β、AlInFa、CYP7A1、KLF、f

9、erritin、Hypo2、MMPvar、CDD、SOCS-2、Profilin、Hypo、TIMp、UbCoE等14個(gè)基因的差異表達(dá)特性。證實(shí)GlSTrs、CYP7A1、Hypo2、TIMp、CDD、AlInFa、MMPvar、Hypo等8個(gè)基因受細(xì)菌誘導(dǎo)時(shí)間影響在血淋巴細(xì)胞內(nèi)顯著的上調(diào)表達(dá)。 本項(xiàng)研究首次從基因組學(xué)的角度出發(fā)，分析雜色鮑響應(yīng)細(xì)菌攻毒血淋巴細(xì)胞差異表達(dá)基因。鮑免疫相關(guān)基因的研究為進(jìn)一步探討鮑抗感染免疫機(jī)制和提高