淋巴細(xì)胞活化基因3(lag3)表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte-activation gene3，lag3），又稱CD223，是屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）的細(xì)胞膜蛋白，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與CD4分子非常相似，基因位置鄰近CD4。早期研究顯示，LAG3在人體內(nèi)的表達(dá)局限于外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的少數(shù)亞群上，如活化的T淋巴細(xì)胞和漿

2、細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞等。研究表明LAG3對T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)有重要作用，且與多種疾病狀態(tài)下的免疫失調(diào)相關(guān)，但lag3基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制依然不明確。本文利用LAG3表達(dá)水平有差異的3個(gè)T細(xì)胞系（CEM，Jurkat E6-1，Jurkat ZM細(xì)胞系），對T細(xì)胞中l(wèi)ag3基因表達(dá)調(diào)控的部分機(jī)制進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)中的CpG島岸(CpG island shore)的DNA甲基化將抑制lag3基因的轉(zhuǎn)錄。
　　首先，我們從mRNA

3、和蛋白水平對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有T細(xì)胞系的LAG3表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞系中LAG3表達(dá)有差異且受到轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。通過比對人與老鼠的基因組序列，鑒定到lag3啟動(dòng)子中存在兩個(gè)潛在的保守調(diào)控區(qū)CRA和CRB(conserved region A&B)。利用DNaseⅠ高敏感位點(diǎn)的分析方法，我們發(fā)現(xiàn)在LAG3+的Jurkat E6-1細(xì)胞亞群中，CRA和CRB對DNaseⅠ的處理敏感。將包含CRA和CRB的lag3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transc

4、ription start site，TSS)上游片段擴(kuò)增并構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒p.basic，發(fā)現(xiàn)該區(qū)段具有較高啟動(dòng)子活性。進(jìn)一步，通過截?cái)鄦?dòng)子發(fā)現(xiàn)CRB是該啟動(dòng)子區(qū)段中的核心序列，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CRB在LAG3表達(dá)水平極低的CEM和Jurkat ZM細(xì)胞中亦具有高啟動(dòng)活性，提示我們這兩種細(xì)胞內(nèi)源的LAG3表達(dá)受到了表觀遺傳調(diào)控。接下來，我們利用Methprimer軟件預(yù)測到了一個(gè)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的CpG島IS及其上游的位于CRB區(qū)的CpG島岸，亞硫

5、氰酸鹽測序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測表明:IS處于穩(wěn)定的高度甲基化水平，而CpG島岸的DNA甲基化水平與LAG3在3個(gè)T細(xì)胞系上的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI將CRB體外甲基化可以顯著降低其啟動(dòng)子活性，表明CRB甲基化對lag3基因轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。此外，使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dc處理LAG3表達(dá)水平低的CEM和JurkatZM細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者的LAG3 mR

6、NA和蛋白表達(dá)水平均得到一定程度的提升，同時(shí)觀察到CRB甲基化水平的顯著降低。為了確定CRB甲基化對人原代T細(xì)胞中l(wèi)ag3基因的調(diào)控作用，我們檢測了原代T細(xì)胞的CRB甲基化，發(fā)現(xiàn):相較于作為LAG3表達(dá)陰性對照的B淋巴細(xì)胞，原代CD8+T淋巴細(xì)胞的各記憶亞群上CRB的甲基化水平均低。
　　綜上，我們的數(shù)據(jù)表明:發(fā)生在CpG島岸上的DNA甲基化對于人T細(xì)胞系中l(wèi)ag3基因轉(zhuǎn)錄而言是一種重要的表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制，而CRB的低甲基化水平可