乙型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)異質(zhì)性與宮內(nèi)感染關(guān)系的探究.pdf

1、目的:
　　 HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生主要與病毒本身、母體和胎兒的免疫狀況、胎兒的易感性、及胎盤因素等有關(guān)。而HBV感染的患者體內(nèi)存在著不同的HBV病毒株，呈現(xiàn)“相似株”的現(xiàn)象，即一異質(zhì)性群體。國(guó)內(nèi)學(xué)者傾向于從研究病毒如何突破胎盤屏障入手來(lái)探討宮內(nèi)傳播的機(jī)制，但對(duì)于乙肝病毒本身的結(jié)構(gòu)及其突變所造成的編碼產(chǎn)物不同是否影響宮內(nèi)傳播的研究不夠系統(tǒng)。介于宮內(nèi)傳播確切的傳播機(jī)制仍不很清楚，因而有必要從HBV基因結(jié)構(gòu)入手，著眼于這一異質(zhì)性群體，

2、運(yùn)用了分子生物學(xué)的技術(shù)方法，結(jié)合臨床流行病學(xué)的資料，分析HBV基因的變異，以及變異所帶來(lái)翻譯產(chǎn)物的不同來(lái)初步篩選可能與宮內(nèi)感染有關(guān)的特異性基因結(jié)構(gòu)，探討HBV基因異質(zhì)性與宮內(nèi)感染的可能關(guān)系，從而為阻斷HBV的宮內(nèi)傳播提供有效的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 ①收集2001年11月～2009年7月于太原市第三人民醫(yī)院足月分娩的1622例HBsAg陽(yáng)性孕婦及其新生兒外周血，剔除母兒血清缺失，篩選其中HBsAg和HBVDNA均

3、陽(yáng)性孕婦且其新生兒HBVDNA陽(yáng)性的母嬰對(duì)，共22對(duì)。根據(jù)克隆測(cè)序的要求（HBVDNA拷貝數(shù)≥105），最終篩選8對(duì)母嬰對(duì)作為宮內(nèi)感染組，同期收集HBsAg和HBVDNA均陽(yáng)性母親但其新生兒HBVDNA陰性的8例母親納入宮內(nèi)未感染組。
　　 ②提取血清中HBVDNA，分別擴(kuò)增宮內(nèi)感染組8對(duì)母嬰和未感染組8例母親HBVDNA前S/S區(qū)1.2kb基因片段及前C/C區(qū)909bp基因片段，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化后克隆入pUCm-T載體，最后經(jīng)

4、PCR酶切鑒定、測(cè)序，共得到宮內(nèi)感染組6對(duì)母嬰、宮內(nèi)未感染組3例母親前S/S區(qū)86株HBV序列及宮內(nèi)感染組6對(duì)母嬰、宮內(nèi)未感染組3例母親前C/C區(qū)67株HBV序列，采用Lasergene中Megalin功能對(duì)測(cè)序結(jié)果較好的82株HBV前S/S基因及67株HBV前C/C基因全部序列進(jìn)行分析，確定基因型并構(gòu)建種系進(jìn)化樹，比較宮內(nèi)感染組前S/S區(qū)核苷酸序列與各基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列的相似率。
　　 ③比較發(fā)生宮內(nèi)感染的6對(duì)母嬰間前S/S區(qū)基

5、因相似性的高低以及種系進(jìn)化關(guān)系；比較母親和嬰兒間各克隆株的相似率，并判斷相似率的高低；最后比較6對(duì)母嬰間前S/S區(qū)及前C/C區(qū)HBV序列間基因位點(diǎn)的不同。
　　 ④分別比較宮內(nèi)感染組母親和未感染組母親、宮內(nèi)感染組新生兒和未感染組母親之間核苷酸序列的差異。
　　 ⑤比較不同基因型的宮內(nèi)感染率，進(jìn)而分析HBV基因型與宮內(nèi)感染的關(guān)系；并比較HBV核苷酸序列的差異和宮內(nèi)感染的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 ①?gòu)?例新

6、生兒(NA～NF)血清中分別擴(kuò)增得到1.2kb和909bpDNA片段，同時(shí)從該6例新生兒的HBsAg和HBVDNA均陽(yáng)性母親(MA～MF)血清中擴(kuò)增得到1.2kb和909bpDNA片段。此外，從同期新生兒未感染的3例HBVDNA陽(yáng)性母親(I、J、K)血清中也擴(kuò)增到1.2kb和909bpDNA片段。
　　 ②用79株HBV序列的前S/S區(qū)和GenBank中A~F基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列的前S/S區(qū)構(gòu)建HBV的種系進(jìn)化樹，并同時(shí)用每例樣本的

7、各克隆株共82株克隆株與GenBank中A～Y基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列的前S/S區(qū)構(gòu)建HBV的種系進(jìn)化樹，其中74株HBV克隆株與C基因亞型的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)化距離最近，宮內(nèi)感染組母親的65株克隆株前S/S區(qū)的所有核苷酸序列與M12906的相似率最高，平均為96.25％，與A、B、D、E、F基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列的平均相似率分別為91.32%、91.46%、88.45%、87.22%、85.43%，與6個(gè)基因亞型間的相似率存在差別（F=98.944，P=0

8、.00）。
　　 ③將前S/S區(qū)的82株核苷酸序列及前C/C區(qū)的66株核苷酸序列分別與C基因型的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，得到每一株克隆序列的相似率，然后求得平均相似率分別為96.5%、98.32%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析得此兩基因區(qū)的核苷酸相似率存在差別(t=-3.096，p=0.007)，且核苷酸相似率以前C/C區(qū)高于前S/S區(qū)。
　　 ④發(fā)生宮內(nèi)感染的6對(duì)母嬰HBV前S/S區(qū)序列中，每一例新生兒HBV克隆株間的平均差異率各為99.8

9、3%、99.83%、99.10%、99.51%、99.61%、96.52%，每一例母親HBV株的平均差異率分別為99.05%、99.04%、99.3g%、99.3g%、99.47%、94.69%，新生兒HBVDNA的相似性高于母親（t=2.119，p=0.088）；前S/S區(qū)各母嬰對(duì)間HBV序列間平均相似率分別為98.81%、99.29%、99.28%、99.45%、99.52%、95.61%母嬰HBV序列間一致性較高。分別以每一對(duì)母嬰

10、核苷酸序列的前S/S區(qū)構(gòu)建種系進(jìn)化樹，可以看出每一對(duì)母嬰序列間的進(jìn)化距離都比較小，分別為0.9、2.9、1.2、0.7、0.7、4.9，表明發(fā)生宮內(nèi)傳播母嬰體內(nèi)HBV間的進(jìn)化距離較小，親緣關(guān)系比較接近。且發(fā)生宮內(nèi)傳播的母嬰序列中，母體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)株和新生兒體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)株是不完全一樣的。其中，MA的優(yōu)勢(shì)株在NA中沒(méi)有檢到，ME的弱勢(shì)株成為NE中的優(yōu)勢(shì)株，MB和MD的優(yōu)勢(shì)株在新生兒體內(nèi)出現(xiàn)的頻率高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)“a”抗原決定簇(nt524～nt595

11、)內(nèi)的兩個(gè)基因位點(diǎn)nt529和nt531發(fā)生突變。
　　 ⑤通過(guò)對(duì)攜帶各種HBV基因型的孕婦發(fā)生宮內(nèi)感染的情況分析可得，攜帶HBVC型孕婦共48例其宮內(nèi)感染率為64.6%，攜帶HBVB型孕婦3例其宮內(nèi)感染率為100%，C型與B型的宮內(nèi)感染率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)尚不能認(rèn)為兩者差別（x2=0.427，p=0.513）。
　　 ⑥通過(guò)對(duì)宮內(nèi)感染組新生兒，宮內(nèi)感染組母親和末感染組HBVDNA陽(yáng)性母親序列的比較，可以看出克隆株間差異率從未

12、感染組母親、宮內(nèi)感染組母親到宮內(nèi)感染組新生兒呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，且其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fs=26.389，p<0.000;Fc=5.680，p=0.004)，同時(shí)每個(gè)組內(nèi)前S/S區(qū)基因的核苷酸差異率與前C/C區(qū)基因的差異率均有差別。
　　 結(jié)論:
　　 ①本研究共得到前S/S區(qū)86條克隆株，在判斷基因型別及研究相似率及差異率時(shí)剔除了7條測(cè)序效果不好影響分析結(jié)果的克隆株，最終得到82株克隆株，分析得其中74株屬于C基因亞型，

13、8株屬于B基因亞型，故可以得出太原地區(qū)HBsAg和HBVDNA均陽(yáng)性的孕婦及新生兒攜帶HBV基因型以C型為主，B型較少，這一分布符合我國(guó)HBV基因型的流行病學(xué)空間分布特點(diǎn)。
　　 ②對(duì)發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的6例新生兒及其母親HBV克隆序列間進(jìn)行種系進(jìn)化分析，比較序列間相似性和差異性且序列間的變異位點(diǎn)，得到母嬰序列間具有同源性并支持了HBV由母體向新生兒的傳播方向。且由結(jié)果可知：母體內(nèi)HBV異質(zhì)性群體中不分優(yōu)勢(shì)和弱勢(shì)群，均可以通過(guò)宮

14、內(nèi)傳播感染新生兒，單株感染和混合感染均有發(fā)生，且母體內(nèi)和新生兒體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)株并不相同，提示HBV的宮內(nèi)感染存在選擇性。
　　 ③對(duì)3例B基因亞型和51例C基因亞型的孕婦宮內(nèi)感染情況進(jìn)行分后，發(fā)現(xiàn)B型和C型在宮內(nèi)感染的過(guò)程中不存在哪種基因型更具有宮內(nèi)感染的優(yōu)勢(shì)。
　　 ④前S/S區(qū)和前C/C區(qū)的宮內(nèi)感染組內(nèi)母親和新生兒以及宮內(nèi)未感染組的母親的序列差異性相比較，可以看到在差異率從未感染組母親、宮內(nèi)感染組母親到宮內(nèi)感染組新生兒呈

15、現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，且其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fs=26.389，p<0.000;Fc=5.680，p=0.004）。同時(shí)每個(gè)組內(nèi)前S/S區(qū)基因的核苷酸差異率與前C/C區(qū)基因的差異率均是前S/S區(qū)的高于前C/C區(qū)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　 ⑤通過(guò)分別對(duì)宮內(nèi)感染組母嬰間，宮內(nèi)感染組母親與未感染組母親以及宮內(nèi)感染組嬰兒與未感染組母親間的序列比對(duì)，初步篩選出系列的變異位點(diǎn)，這些變異以突變?yōu)橹?，間或也有缺失與插入，但總體呈現(xiàn)