2型糖尿病腎病差異表達蛋白質的研究.pdf

1、第一部分表面加強激光解吸電離一飛行時間一質譜技術方法的建立和優(yōu)化 目的：建立和優(yōu)化表面加強激光解吸電離一飛行時間一質譜(SELDI-TOF-MS)技術平臺。 方法：取華山醫(yī)院內分泌科住院的2型糖尿病。腎病(DN)病人4例、2型糖尿病不伴腎病病人2例、正常人2例的血清和晨尿上清液標本。取病理證實的2型糖尿病腎病病人的腎臟皮質標本及正常腎臟皮質標本各l例，抽提總蛋白，Bradford法定量。采用WCX2、H4、SAX2、IM

2、AC3-Cu2+四種蛋白質芯片，經SELDI-TOF-MS測定蛋白質譜，摸索處理血清、尿液上清和組織蛋白的最佳蛋白質芯片種類和技術參數，評估該技術的穩(wěn)定性和可靠性。 結果：血清蛋白質圖譜顯示蛋白峰最多的為WCX2芯片；尿液上清蛋白質圖譜顯示蛋白峰最多的為IMAC3-Cuz+芯片；腎臟皮質組織蛋白質圖譜顯示蛋白峰最多的為WCX2芯片。WCX2芯片激光強度185，敏感性8；IMAC3-Cu~+芯片激光強度230，敏感性9；SAX2芯

3、片激光強度185，敏感性8；H4芯片激光強度210，敏感性9可獲得相對較好的圖譜。同一芯片內蛋白質峰強度的變異系數(Cv)值為16．72％，質荷比(m／z)的CV值為0．0236％；不同芯片間蛋白質峰強度的CV值為16．76％，m／z的CV值為0．0207％。 結論：血清蛋白質組研究宜選用弱陽離子交換表面芯片，研究尿液上清蛋白質組宜選用銅離子螯合表面芯片，腎臟皮質蛋白質組研究宜選用弱陽離子交換表面芯片。蛋白質芯片SELDI-TO

4、F-MS技術重復性高、穩(wěn)定性好，是比較理想的蛋白質組學研究平臺。選擇最佳參數及操作過程的標準化對獲得可靠的圖譜十分重要。 第二部分2型糖尿病腎病尿液蛋白質指紋圖譜及診斷決策樹模型的建立 目的：篩選尿液上清中2型糖尿病腎病的生物標記物，建立DN診斷決策樹模型，并為探討DN形成的分子機制提供研究基礎。 方法：收集72例2型糖尿病腎病患者、33例2型糖尿病不伴腎病患者和29例正常人晨尿上清，采用銅離子螯合表面芯片(IM

5、AC3-Cu2+)，經SELDI-TOF-MS測定得到蛋白質指紋圖譜。其中42例DN患者和42例非DN(nonDN)患者組成訓練集，通過BiomarkerwizardSoftware3．1比較兩者間尿液上清蛋白質譜的差異，利用BiomarkerPatternsSoftware5．0．2建立DN的診斷決策樹模型。其余30例DN患者和20例nonDN患者組成測試集，對模型進行盲法驗證。 結果：IMAC3-Cu2+芯片建立訓練集的蛋白

6、質指紋圖譜中，DN與nonDN相比較，17個蛋白峰強度相差2倍以上且有統(tǒng)計學意義(P<0．01)，平均m／z為5878．37，¨739．37，11967．94，39943．56，66614．06和79433．58的蛋白峰在DN組中上調，而平均m／z為2380．42，3031．64，3899．56，4632．28，4647．32，4760．04，4820．6l，4909．51，4966．93，4984．44，5078．44的蛋白峰在DN組

7、中下調。其中4個蛋白建立了DN診斷模型，盲法驗證該模型準確率86．00％(43／50)，敏感性86．67％(26／30)，特異性85．00％(17／200，陽性預測值89．66％(26／29)，陰性預測值80．95％(17／21)。 結論：DN尿液上清的蛋白質指紋圖譜經過BiomarkerPatternsSoftware處理后可以得到DN的診斷決策樹模型。模型準確性好，可提供全新的2型糖尿病腎病診斷方法。對差異表達蛋白的進一步研

8、究可能有助于闡明糖尿病腎病的發(fā)病機理。 第三部分2型糖尿病腎病血清蛋白質指紋圖譜及診斷決策樹模型的建立 目的：篩選血清中2型糖尿病腎病的生物標記物，建立DN診斷決策樹模型，并為探討DN形成的分子機制提供研究基礎。 方法：收集87例2型糖尿病腎病患者、36例2型糖尿病不伴腎病患者和57例正常人血清，采用弱陽離子芯片CMIO，經SELDI-TOF-MS測定得到蛋白質指紋圖譜。其中65例DN患者和65例nonDN患者組

9、成訓練集，通過BiomarkerwizardSoftware3．1比較兩者問血清蛋白質譜的差異，利用BiomarkerPatternsSoftware5．O．2建立DN的診斷決策樹模型。其余22例DN患者和28例nonDN患者組成測試集，盲法驗證模型的準確性。 結果：CMiO芯片建立訓練集的蛋白質指紋圖譜中，DN與nonDN相比較，46個蛋白峰強度相差2倍以上且有統(tǒng)計學意義(P

10、z為2505．52，2654．90，3059．07，3253．57，3410．86，3632．77，3668．36，3750．06，4507．37，4558．50，4658．15，4890．31，5078．20，5205．38，5305．65，5318．32，55¨．76，5710．27，5761．叭，5955．42，5973．47和6779．00；而平均m／z為2049．75，2052．8l，2233．97，2235．56，2759．

11、27，2872．63，2936．91，2939．U，3197．31，3266．07，3268．77，3272．09，3402．16，3482．81，3940．55，3961．90，4075．89，4079．94，4096．02，4¨1．08，4301．82，4969．90，5639．47和6194．51的22個蛋白峰在DN組中下調。其中6個蛋白建立了DN診斷決策樹模型，盲法驗證該模型準確率90．00％(45／50)，敏感性90．91％(