鞘氨醇激酶2對(duì)全反式維甲酸腫瘤抑制活性的影響.pdf

1、研究背景:
　　在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中，鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，Sphk)及其代謝產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)的作用備受關(guān)注。作為一種脂類激酶，SphK在細(xì)胞遷徙、增殖、凋亡等過程中具有重要的調(diào)控作用。機(jī)體內(nèi)的重要脂質(zhì)鞘氨醇可通過Sphk的催化而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写偕L(zhǎng)作用的因子S1P，也可通過神經(jīng)酰胺合成酶的作用轉(zhuǎn)變成誘導(dǎo)凋亡作用的因子神經(jīng)酰胺（ceramide

2、，Cer）。S1P/Cer的平衡能夠決定細(xì)胞生存還是凋亡，而Sphk是調(diào)節(jié)這一平衡的關(guān)鍵酶，因此Sphk是細(xì)胞存亡的重要調(diào)節(jié)者。
　　維甲酸類藥物是維生素A的結(jié)構(gòu)及功能類似物的總稱，這類物質(zhì)對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用。維甲酸類藥物的作用主要由核內(nèi)受體維甲酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)介導(dǎo)，通過激活RAR/RXR二聚體促進(jìn)含有RXRs或RARs識(shí)別元件的靶基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。維甲酸受體的表達(dá)缺失是癌癥發(fā)生過程中

3、的常發(fā)與重要事件，可能導(dǎo)致腫瘤對(duì)維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性。
　　本課題旨在將細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性高低同鞘氨醇激酶聯(lián)系起來，探討SphK2的下調(diào)能否提高腫瘤細(xì)胞對(duì)全反式維甲酸的敏感性以及其相關(guān)作用機(jī)制。該項(xiàng)研究的對(duì)于深入了解鞘臘類代謝產(chǎn)物S1P介導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生對(duì)維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性、發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)和設(shè)計(jì)維甲酸衍生物具有指導(dǎo)意義。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　以小RNA干擾技術(shù)(SiRNA)抑制SphK2表達(dá)從而降低SphK2和S1P水平

4、，以克隆形成法檢測(cè)加入S1P以及干擾SphK2對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并檢測(cè)ATRA對(duì)野生型HT-29以及SiSphK2處理HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制能力。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)S1P升高和降低分別對(duì)ATRA所致的細(xì)胞G1期阻滯和細(xì)胞凋亡作用的影響。以Western blotting法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)S1P對(duì)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞RARβ表達(dá)的影響以及相關(guān)周期、凋亡和PI3K/AKT等細(xì)胞通路的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　Wes

5、tern blotting以及real-time PCR結(jié)果表明SiRNA能特異性降低SphK2水平約80％，且在96h內(nèi)能夠保持在對(duì)照組的20-30％。0.1μM的S1P能夠拮抗10μM ATRA引起的HT-29細(xì)胞增殖抑制、受體RARβ的表達(dá)、細(xì)胞G1期阻滯和細(xì)胞凋亡;相反，SphK2干擾降低細(xì)胞SphK2水平和S1P水平，從而增強(qiáng)ATRA引起的細(xì)胞增值抑制、受體RARβ的表達(dá)、細(xì)胞G1期阻滯和細(xì)胞凋亡。Western blotti