丹參骨寶2號(hào)制備及其體內(nèi)外抗骨質(zhì)疏松作用研究.pdf

1、【目的】 探討丹參骨寶 2 號(hào)(丹參水溶性有效部位群，salvia miltiorrhiza active aqueous extract，DUAE)的制備工藝，質(zhì)量控制及體內(nèi)體外抗骨質(zhì)疏松作用研究。 【方法】 1、丹參骨寶2號(hào)制備工藝的研究： 丹參骨寶2號(hào)的制備工藝以丹參素含量最高為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合高效液相(HPLC)法含量測(cè)定，經(jīng)過(guò)多次正交試驗(yàn)比較不同濃度、不同種類的酸或堿，溫度，提取時(shí)間等外加因素對(duì)丹參水

2、溶性有效部位群中有效成分丹參素，丹酚酸 B，原兒茶醛含量的影響，得出九種丹參的水溶性有效部位群的提取物(命名為1-9號(hào))，然后以丹參素含量最高者定為丹參骨寶2號(hào)。 2、丹參骨寶2號(hào)制備工藝的質(zhì)量控制： 采用符合2005版中國(guó)藥典一部規(guī)定的丹參藥材標(biāo)準(zhǔn)以丹參素、丹酚酸 B、原兒茶醛為對(duì)照，建立高效液相(HPLC)的定量分析方法，用于丹參骨寶2號(hào)制備工藝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制。 3、丹參骨寶2號(hào)對(duì)體外成骨細(xì)胞活性試驗(yàn)評(píng)價(jià)：

3、 采用酶序列消化分離培養(yǎng)法培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞。應(yīng)用堿性磷酸酶染色法、茜紅素染色法等方法鑒定成骨細(xì)胞，評(píng)價(jià)丹參骨寶2號(hào)與不同制備工藝制得的DUAE對(duì)體外培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞的ALP含量、骨鈣素含量的影響。體外成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組如下，0組：空白對(duì)照組，加入不含血清的DMEM對(duì)照。1組：加入1號(hào)制備工藝制得的DUAE，2組：加入2號(hào)，3組：加入3號(hào)，4組：加入4號(hào)，5組：加入5號(hào)，6組：加入6號(hào)，7組：加入7號(hào)，8組：加入8號(hào)

4、，9組：加入9號(hào)，10組：加入丹參素標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為2×10<'-2>mg/L，4.05×10<'-2>mg/L，8.1×10<'-2>mg/L，1.62×10<'-1>mg/L，3.24×10<'-3>mg/L。11組：加入丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為2.25×10<'-2>mg/L，4.5×10<'-2>mg/L，8.98×10<'-2>mg/L，1.8×10<'-1>mg/L，3.6×10<'-1>mg/L。12組加入原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)

5、品終濃度分別為2.16×10<'-3>mg/L，4.32×10<'-3>mg/L，8.63×10<'-3>mg/L，1.73×10<'-2>mg/L，3.45×10<'-2>mg/L。13組加入復(fù)方丹參片。 4、丹參骨寶2號(hào)對(duì)糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松作用評(píng)價(jià)： 用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致SD大鼠骨質(zhì)疏松模型，評(píng)價(jià)丹參骨寶2號(hào)抗骨質(zhì)疏松作用。實(shí)驗(yàn)采用4月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分成5組?？瞻讓?duì)照組(蒸餾水 0.5 ml·k

6、g<'-1>·d<'-1>)、潑尼松組(3.5mg·kg<'-1>·d<'-1>)、丹參骨寶2號(hào)中劑量組、丹參骨寶2號(hào)低劑量組、丹參骨寶1號(hào)組，均灌胃給藥，每天一次，連續(xù)90天。大鼠處死后取左側(cè)股骨上段進(jìn)行不脫鈣骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量分析．右側(cè)股骨作生物力學(xué)性能(最大載荷、最大位移、最大能量吸收、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變和彈性模量)的測(cè)定。 【結(jié)果】 1、丹參骨寶2號(hào)制備工藝： 丹參骨寶2號(hào)的制備工藝確定為以鹽酸前處理的

7、提取方法，該制備方法顯著提高了丹參水溶性成分，丹參素、原兒茶醛的含量，且丹參素與丹酚酸 B 的比例為1∶l。丹參骨寶2號(hào)制備方法與傳統(tǒng)水提(丹參骨寶1號(hào))制備方法比較，丹參素含量提高4.69倍，達(dá)11.2mg/g(生藥)，丹酚酸B含量減半，減為12.8mg/g(生藥)且兩者含量均在1％以上，原兒茶醛含量加至0.26mg/g(塵藥)。 2、丹參骨寶2號(hào)制備工藝的質(zhì)量控制： 本研究以丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照建立高

8、效液相(HPLC)的定量分析方法，同時(shí)也初步建立了丹參骨寶2號(hào)的指紋圖譜(結(jié)果參見(jiàn)32頁(yè)，33頁(yè)圖3.4)。 3、體外成骨細(xì)胞試驗(yàn)評(píng)價(jià)丹參骨寶2號(hào)制備工藝： 通過(guò)體外成骨細(xì)胞試驗(yàn)對(duì)丹參骨寶及不同制各工藝制備的丹參水溶性有效部位群進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)丹參骨寶2號(hào)制備方法可以顯著提高對(duì)大鼠成骨細(xì)胞活性。丹參骨寶2號(hào)制備方法與丹參骨寶1號(hào)制備方法比較，丹參骨寶1號(hào)藥量為1 mg(生藥)/L 時(shí)僅提高成骨細(xì)胞 ALP 活性 5.5％

9、(p>0.05)。丹參骨寶2號(hào)藥量為0.25 mg(生藥)/L時(shí)提高成骨細(xì)胞ALP活性達(dá)52％(p<0.05)。 4、丹參骨寶2號(hào)對(duì)糖皮質(zhì)激素致大鼠骨質(zhì)疏松作用評(píng)價(jià)： 丹參骨寶2號(hào)和丹參骨寶1號(hào)應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素所致的大鼠骨質(zhì)疏松試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：兩者均有防治糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的大鼠骨質(zhì)疏松的作用。與模型組比較，丹參骨寶2號(hào)能增加骨小梁百分?jǐn)?shù)97.6％(P<0.01)，骨小梁厚度 39.2％(P<0.01)，骨小梁數(shù)量 43.8％(P

10、<0.01)，降低骨小梁分離度 34.2％，(P<0.01)；丹參骨寶1 號(hào)增加骨小梁百分?jǐn)?shù) 98.8％(P<0.01)，骨小梁厚度 35.9％(P<0.01)，骨小梁數(shù)量 46.1％(P<0.01)，降低骨小梁分離度 38.3％(P<0.01)。兩者都可以使大鼠的骨量增加、骨小梁密度升高而分離度降低。GC對(duì)大鼠7項(xiàng)骨生物力學(xué)指標(biāo)有下降趨勢(shì)(P>0.05)，丹參骨寶1號(hào)對(duì)GC導(dǎo)致大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)：斷裂應(yīng)力，彈性模量，彈性應(yīng)力，最大應(yīng)力

11、的下降趨勢(shì)有微弱的提高作用(P>0.05)，丹參骨寶2號(hào)對(duì)本次試驗(yàn)檢測(cè)的7個(gè)骨生物力學(xué)指標(biāo)均有微弱的提高作用(P>0.05)。 【結(jié)論】 用鹽酸前處理方法得到的丹參骨寶2號(hào)的制備工藝與傳統(tǒng)水提法得到的丹參骨寶1號(hào)比較，丹參骨寶2號(hào)的丹參素含量提高4.69倍，達(dá)11.2 mg/g(生藥)，丹酚酸B含量減半，減為12.8 mg/g(生藥)且兩者含量均在1％以上，原兒茶醛含量加至0.26mg/g(生藥)。并且該方法，成分含量穩(wěn)

12、定質(zhì)量可控。 體外成骨細(xì)胞活性測(cè)定方法發(fā)現(xiàn)，丹參骨寶2號(hào)對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性、分泌骨鈣素水平的影響優(yōu)于丹參骨寶1號(hào)，說(shuō)明對(duì)OB有促進(jìn)作用的有效成分主要是丹參素以及適當(dāng)?shù)⑺?丹酸酚B的比例；探討了通過(guò)不同含量的DUAE對(duì)OB的ALP水平的影響篩選出抗骨質(zhì)疏松作用最佳的藥物的方法。 丹參骨寶2號(hào)和丹參骨寶1號(hào)應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素所致的大鼠骨質(zhì)疏松試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：兩者均有防治糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的大鼠骨質(zhì)疏松的作用，丹參骨寶2號(hào)優(yōu)于丹參