海灣扇貝酶解物的制備、鑒定及其體內(nèi)外抗腫瘤作用研究.pdf

1、海洋生物提取物多具有抗腫瘤活性，扇貝是海洋生物的一種，由于其營養(yǎng)價(jià)值高且含有多種生理活性成分，因此在海洋抗癌藥物研究中具有很好的應(yīng)用和開發(fā)前景。本研究以海灣扇貝為原料，研究了海灣扇貝酶解物的制備、鑒定、抗腫瘤作用及其可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.研究提出了海灣扇貝酶解物制備工藝條件，證明該酶解物具有較高的體外抗氧化活性。
　　以去除內(nèi)臟的海灣扇貝肉為原料，按固液比(g∶mL)1∶6.25加水勻漿，按1312.82U/

2、g加入酸性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值到3.53，50℃恒溫水解4h，所得海灣扇貝酶解物的DPPH自由基清除率達(dá)到91.59％。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，10mg/mL該酶解物的紅細(xì)胞氧化溶血度(93.59％)與0.1 mg/mL Vc的紅細(xì)胞氧化溶血度(96.63％)差異不顯著，10mg/mL該酶解物抗亞油酸過氧化能力(96.26％)顯著高于1.0mg/mL Vc(67.74％)和0.1mg/mLVc(40.65％)的抗亞油酸過氧化能力(P＜0.05

3、)，說明該酶解物具有較高的抗氧化活性。
　　2.測定了海灣扇貝酶解物的氨基酸組成及含量，鑒定了該酶解物中海灣扇貝多肽的一級結(jié)構(gòu)。
　　用柱前衍生反相高效液相色譜法測出海灣扇貝酶解物中包含14種游離氨基酸，多肽混合物中包含13種氨基酸，按含量由高到低依次為:精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和亮氨酸。經(jīng)串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI TOF/TOF）鑒定，5個(gè)多

4、肽組分的氨基酸序列分別為:組分1(m/z為706.3)Cys-Cys-Ser-His-Thr-Arg;組分2(m/z為718.3) Asn-Gly-Trp-Val-Thr-Arg;組分3(m/z為730.3)Gly-Asn-Pro-Met-Arg-Arg;組分4（m/z為741.4）Asp-His-Trp-Lys-Arg;組分5（m/z為908.5）Cys-Thr-Tyr-Gly-Pro-Val-Leu-Arg。
　　3.研究了海

5、灣扇貝酶解物對體外培養(yǎng)的兩種肝癌細(xì)胞的影響，證明該酶解物的體外抗腫瘤效果。
　　CCK-8法測出不同濃度海灣扇貝酶解物均能顯著抑制人肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的生長(P＜0.01)，且抑制率隨酶解物濃度的升高而增加。其中，12mg/mL海灣扇貝酶解物組的抑制率分別為60.4％和64.2％，顯著高于其他組的抑制率(P＜0.01);經(jīng)倒置顯微鏡觀察，該組兩種細(xì)胞的形態(tài)較對照組均發(fā)生了明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、透明度降低、細(xì)

6、胞核固縮等，并出現(xiàn)了凋亡小體;經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，該組兩種細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高(P＜0.01);p53蛋白陽性率均顯著增高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白陽性率均顯著降低(P＜0.01)。由此可知，海灣扇貝酶解物體外抗腫瘤的作用機(jī)制可能為:①通過上調(diào)p53蛋白表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，并經(jīng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;②通過線粒體通路下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　4.研究了灌胃海灣扇貝酶解物對H2

7、2荷瘤小鼠的影響，證明該酶解物的體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　對H22荷瘤小鼠灌胃不同劑量的海灣扇貝酶解物后，低劑量組（500 mg/Kg·d-1）、中劑量組（1000 mg/Kg·d-1）和高劑量組(1500 mg/Kg·d-1)的抑瘤率分別為28.16％、41.93％和84.00％，具有量效依賴趨勢。與模型組相比，中劑量組小鼠血清中MDA和8-iso-PGF2α的水平顯著降低(P＜0.05)，SOD、IL-2、IL-12、GSH-Px

8、和TNF-α的水平顯著升高(P＜0.05);中劑量組小鼠腫瘤組織提取液中突變型p53、Survivin、MDA、8-OHdG和8-iso-PGF2α的水平顯著降低（P＜0.05），SOD和GSH-Px的水平顯著升高(P＜0.05)。腫瘤組織病理學(xué)觀察也表明該酶解物有較好的抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)。以上結(jié)果證明，海灣扇貝酶解物對小鼠肝癌H22具有明顯的抑制作用，且中劑量組效果較優(yōu)。由此可知，海灣扇貝酶解物體內(nèi)抗腫瘤的作用機(jī)制可能為:①通過提高機(jī)體