乳腺癌EphA2，EphrinA1，ERα，ERβ和PR的表達及RNAi沉默EphA2基因的實驗研究.pdf

1、乳腺癌是嚴重危害人類生命健康的常見惡性腫瘤之一,已位居女性腫瘤死亡首位,全球每年約有120余萬婦女患乳腺癌,約50萬婦女死于乳腺癌。其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內呈較快增長趨勢,每年約以0.2～0.3％的速度遞增,且發(fā)病年齡趨向年輕化；已經證實,年齡、疾病分期、腫瘤大小、淋巴結轉移狀況和腫瘤微血管密度等臨床病理學因素與腫瘤預后密切相關,且早期遠處轉移和復發(fā)是腫瘤致死的主要因為。因此,迫切需要尋找一個敏感、能早期預測乳腺癌復發(fā)轉移的分子生物

2、學標志物及抑制其復發(fā)轉移的基因治療靶點,為臨床對乳腺癌的復發(fā)和轉移的早期預測提供一定的參考依據。
　　 乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與人體內雌激素的增加、孕激素的減少密切相關,性激素的代謝素紊亂促進了某些乳腺癌的生長,但其確切發(fā)病機制目前尚不清楚。新近在對乳腺癌細胞中EphA2表達狀況的研究中,越來越多的證據表明EphA2與ER之間存在相互影響。但是對于EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR在乳腺癌中的聯合檢測,國內外少見報道

3、。
　　 新輔助化療是對非轉移性腫瘤局部治療之前進行的全身性、系統(tǒng)性細胞毒性藥物治療。目前新輔助化療已成為局部晚期乳腺癌的標準治療。國際上關于乳腺癌新輔助化療的多中心隨機臨床實驗結果顯示:新輔助化療與輔助化療同樣有效。對新輔助化療敏感的乳腺痛比不敏感者預后好,特別是在局部進展期乳腺癌的應用中已取得良好的效果。新輔助化療后許多病理學和生物學指標都發(fā)生了改變,很多基因表達均發(fā)生了改變。尋找出能夠預測新輔助化療療效并幫助選擇內分泌治療

4、、化療方案、判斷乳腺癌預后的腫瘤分子標記物已經成為目前研究的熱點之一,對于EphA2及ER、PR在新輔助化療前后乳腺癌中的表達的研究,國內外少見報道。
　　 我們通過免疫組織化學技術聯合檢測了EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR的蛋白在乳腺癌中的表達及各自與臨床病理學因素的關系；采用免疫組織化學技術檢測EphA2和ER、PR在新輔助化療前后的乳腺癌組織中的表達情況；用RT-PCR技術研究了EphA2及其配體Ephr

5、inA1各自的mRNA在乳腺癌中的表達及各自與臨床病理學因素的關系；應用逆轉錄病毒載體介導的RNAi技術抑制EphA2在MCF-7細胞中的表達,以期尋找出能幫助選擇有效治療方案及預測乳腺癌預后的有效指標,并探討EphA2在乳腺癌中的作用機制及預后價值,以期為乳腺癌的基因治療提供新的思路。本研究分為四章:
　　 第一章 乳腺癌中EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR蛋白的表達及其意義
　　 目的
　　

6、研究EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR等的蛋白在乳腺癌中的表達及其意義。
　　 方法
　　 1.用免疫組織化學SP法檢測130例乳腺痛組織中EphA2,EphrinA1,ERα,ERβ及PR等各自蛋白的表達水平及其與臨床病理因素的關系。
　　 2.統(tǒng)計學處理:用spss13.0 for windows統(tǒng)計軟件包對所有資料進行統(tǒng)計學處理。采用卡方檢驗(chi-square),t(studert t)

7、檢驗,方差分析(ANVOA),相關性檢驗等。顯著性標準為P<0.05。
　　 結論
　　 1.在乳腺癌組織中檢測到EphA2、EphrinA1、ERα、ERβ和PR的蛋白的表達,提示他們可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關。
　　 2.EphA2蛋白在乳腺癌的表達與臨床分期、淋巴結轉移和組織學分級顯著相關,EphrinA1蛋白在乳腺癌的表達與臨床分期、組織學分級顯著相關,ERβ蛋白在乳腺癌的表達與組織學分級相關,提示其潛在

8、的預后價值并有可能成為乳腺癌預后評估的腫瘤標志物。EphA2蛋白高表達與乳腺癌淋巴結轉移有關,提示其可能參與乳腺癌的轉移機制。
　　 3.EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的蛋白表達分布的一致性提示在乳腺癌中,EphrinA1是EphA2受體的主要配體之一,二者可能在乳腺癌細胞信號傳導過程中協(xié)調發(fā)揮作用。EphA2和EphrinA1共同定位于腫瘤細胞和乳腺癌的血管內皮細胞,提示二者可能協(xié)同參與了乳腺癌的血管生成,二者有望成為

9、乳腺癌基因治療的新靶向。
　　 4.乳腺癌組織中有較高的ERα蛋白和ERβ蛋白陽性表達,提示乳腺癌是性激素依賴性腫瘤,可根據受體的含量指導臨床進行內分泌治療。
　　 5.乳腺癌細胞EphA2與EphrinA1的表達顯著相關,提示EphrinA1的表達受EphA2誘導,EphrinA1可以通過自分泌和/或旁分泌環(huán)作用于相應的EphA2受體促進癌細胞增殖及血管形成。
　　 6.在乳腺癌中,EphA2蛋白的表達與ERα

10、蛋白負相關,和ERβ蛋白正相關相關,提示ERα可能副性調控EphA2的表達,而ERβ可能正性調控EphA2的表達。
　　 7.EphA2和EphrinA1的檢測可作為乳腺癌預后的評估指標。
　　 第二章 EphA2、ER、PR在新輔助化療前后乳腺癌中的表達及意義
　　 目的
　　 研究乳腺痛中ER、PR 和EphA2的表達在新輔助化療前后的變化及臨床意義。
　　 方法
　　 采用免疫組化S

11、P法檢測ER、PR和EphA2在52例新輔助化療前后的乳腺癌組織中的表達情況。
　　 結論
　　 新輔助化療能抑制腫瘤細胞增殖,促進腫瘤細胞凋亡,顯著降低EphA2的陽性表達,而對ER、PR的表達無顯著影響。
　　 第三章 乳腺癌中EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA的表達及其意義
　　 目的
　　 研究EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA在乳腺癌中的表達及其意義。

12、　　 方法
　　 1.選擇40例乳腺癌冰凍標本,分別經免疫組化證實有不同級別的EphA2蛋白表達和EphrinA1蛋白表達,用于RNA提取。
　　 2.應用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分別檢測其中EphA2mRNA和EphrinA1mRNA的表達,比較各自mRNA與其蛋白表達的相關性及與臨床病理因素的關系。
　　 3.統(tǒng)計學處理:所有數據均經應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。應用t檢驗(

13、t-test)；方差分析(One-Way ANVOA)；非參數檢驗(Kruskal-Wallis test法)；顯著性標準為P<0.05。
　　 結論
　　 1.乳腺癌癌組織中EphA2 mRNA的表達與組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期均顯著相關(P=0.000)；EphrinA1 mRNA的表達與組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期相關(P=0.000)；提示EphA2 mRNA的陽性表達和EphrinA 1 mRNA的陽

14、性表達均與乳腺癌的惡性行為相關,有可能成為乳腺癌預后的標記物。
　　 2.EphA2mRNA、EphrinA1mRNA的陽性表達與各自蛋白質的表達具有一定的相關性,提示乳腺癌組織中二者主要在轉錄水平調節(jié)。
　　 3.EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA表達水平分別與各自蛋白表達水平的不完全一致,提示二者在乳腺癌中存在某種轉錄后翻譯水平的調控機制和蛋白質積聚或降解通路障礙。
　　 第四章 RNAi靶向沉

15、默乳腺癌細胞系MCF-7中EphA2的表達的研究
　　 目的
　　 探討逆轉錄病毒介導的RNAi對乳腺癌細胞系MCF-7中EphA2表達的影響。以期為乳腺癌的基因治療提供新的思路和手段、
　　 方法
　　 1.根據人EphA2mRNA基因編碼區(qū)序列,按照序列設計原則及網上軟件,設計并合成兩條互補的編碼EphA2shRNA的寡核苷酸序列。
　　 2.兩條互補的編碼EphA2shRNA的寡核苷酸鏈煺火

16、后與線性載體質粒RNAi-READY-pSIREN-RetroQ連接,構建形成重組質粒pSIREN-RetroQ-EphA2,同時用試劑盒提供的陰性對照siRNA雙鏈寡核苷酸構建對照載體pSIREN-RetroQ-C。
　　 3.以重組質粒pSIREN-RetroQ-EphA2轉化大腸桿菌。用堿裂解法少量制備質粒DNA,然后進行酶切鑒定和DNA測序分析。
　　 4.脂質體介導下轉染到包裝病毒細胞株PA317中,并進行克隆

17、與篩選。
　　 5.以重組質粒pSIREN-RetroQ-EphA2轉染MCF-7細胞,并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達的克隆。
　　 6.Westen-blot檢測EphA2蛋白的表達。
　　 結論
　　 1.從EphA2 mRNA序列中篩選出有效的siRNA序列,并設計了互補雙鏈寡核苷酸發(fā)夾結構,成功構建了EphA2 siRNA的逆轉錄病毒表達載體,并將之轉染到MCF-7細胞。
　　 2.通過逆轉錄病