EphA2基因沉默對胃癌SGC-7901細胞侵襲力的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、背景：胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。盡管近年來外科技術(shù)的進步和采用包括化療、放療在內(nèi)的多種治療手段，但世界范圍內(nèi)進展期胃癌的5年生存率仍不超過25％。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、術(shù)后復發(fā)是胃癌患者主要的死亡原因，也是影響臨床治療和預后的關(guān)鍵因素，因此研究胃癌發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的機制具有十分重要的意義。受體酪氨酸激酶(RTKs)在調(diào)控腫瘤細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路中起關(guān)鍵作用。人肝細胞生促紅素(Eph)基因家族是目前已知RTK中最大的亞族，

2、具有受體酪氨酸激酶的活性，能將外界刺激信息傳遞至細胞核并轉(zhuǎn)化成細胞效應(yīng)的信號通路的關(guān)鍵組成部分。其中EphA2受體是已發(fā)現(xiàn)的14種Eph受體中的一員，其基因位于被認為是腫瘤“熱點”的染色體lp36.1。EphA2在許多腫瘤中呈高表達和高活性，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者的預后密切相關(guān)。過表達的EphA2能增強腫瘤細胞向外侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，但是EphA2促進腫瘤侵襲具體的作用機制目前仍不十分清楚。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中重要成員，屬于明膠

3、酶，能降解細胞外基質(zhì)主要成分。目前MMP-9被認為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶。研究表明通過檢測肝細胞癌和卵巢癌組織中EphA2與MMP-9的表達兩者存在正相關(guān)性，但是EphA2是否通過MMP-9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的發(fā)揮作用至今未見相關(guān)報道。
　　 目的：探討EphA2在胃癌侵襲過程中的作用及其可能機制。
　　 方法：
　　 1.采用免疫組織化學法檢測97例胃癌組織和24例正常胃粘膜組織中Eph

4、A2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表達情況，分析胃癌組織中EphA2和MMP-9的表達與臨床病理因素及預后之間的關(guān)系。
　　 2.構(gòu)建特異性EphA2siRNA表達載體，并借助脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入胃癌SGC-7901細胞。實驗分為空白對照組（未轉(zhuǎn)染的胃癌細胞）、陰性對照組（陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌細胞）和EphA2siRNA組（EphA2siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌細胞）。用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(realtimeRT-PCR)

5、檢測EphA2mRNA表達變化，westernblot檢測EphA2蛋白表達變化，噻唑藍法(MTT)觀察細胞生長，流式細胞儀檢測細胞周期，transwell侵襲實驗觀察細胞遷移和侵襲情況，并用realtimeRT-PCR和westernblot檢測MMP-9表達。
　　 3.建立裸鼠皮下胃癌SGC-7901細胞移植瘤模型后，18只裸鼠隨機分成三組：空白對照組（生理鹽水瘤內(nèi)注射）、陰性對照組（陰性對照質(zhì)粒＋脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射）和Eph

6、A2siRNA組（EphA2siRNA質(zhì)粒＋脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射），以上處理隔天一次，共6次。每周定期測量不同處理組裸鼠皮下移植瘤體積，第一次治療后第21天處死裸鼠并測量瘤體重量，并用免疫組織化學法檢測移植瘤EphA2和MMP-9蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.與正常胃粘膜組織相比，胃癌組織中EphA2和MMP-9呈強表達(P＜0.01)；胃癌組織中EphA2和MMP-9蛋白強弱表達均與胃癌的大小、浸潤深度、腫瘤TNM分

7、期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目有關(guān)(P＜0.05)，并且MMP-9蛋白表達與腫瘤分化程度有關(guān)(P＝0.029)；胃癌組織中EphA2和MMP-9蛋白表達呈正相關(guān)(r＝0.732,P＜0.01)；單因素分析EphA2蛋白強表達組5年生存率明顯低于弱表達組(P＝0.037)，并且MMP-9蛋白強表達組5年生存率與弱表達組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.019)；Cox多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)EphA2和MMP-9蛋白強弱表達是影響預后的獨立因素。
　　

8、 2.成功構(gòu)建了EphA2siRNA表達載體并且能高效轉(zhuǎn)入SGC-7901細胞內(nèi)。與陰性對照組比較，EphA2siRNA組中EphA2mRNA和蛋白表達沉默效率分別達到了73.4％和65.1％(P＜0.01)；與空白對照組和陰性對照組比較，EphA2siRNA組中細胞生長受到明顯抑制(P＜0.01)，同時細胞周期分布存在明顯差異，其中G0/G1期比例增高(P＜0.01)，而S期和G2/M期比例降低(P＜0.05)，細胞的增殖指數(shù)亦明顯

9、降低(P＜0.01)，細胞的遷移和侵襲能力下降(P＜0.01)；同時EphA2siRNA組中MMP-9mRNA和蛋白的表達也均顯著下降(P＜0.01)。
　　 3.成功建立胃癌SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤模型，EphA2siRNA組移植瘤體積和瘤體重量均較空白對照組和陰性對照組下降(P＜0.01)，第一次治療后第21天EphA2siRNA組體積抑瘤率達47.5％?？瞻讓φ战M和陰性對照組中EphA2和MMP-9蛋白的表達均高

10、于EphA2siRNA組。
　　 結(jié)論：
　　 1.胃癌組織中EphA2和MMP-9的高表達不僅與胃癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也可作為判斷胃癌患者預后的指標之一。
　　 2.EphA2siRNA表達載體能有效抑制胃癌SGC-7901細胞EphA2mRNA及蛋白的表達。沉默EphA2在胃癌SGC-7901細胞中的表達可抑制SGC-7901細胞生長、增殖、遷移和侵襲以及MMP-9的表達。
　　 3.裸鼠移植瘤瘤