粉防己堿純化、鑒定及其對(duì)人血淋巴細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響.pdf

1、第一部分 粉防己中粉防己堿的純化、鑒定
　　目的：建立高速逆流色譜與柱層析聯(lián)用分離純化粉防己中粉防己堿（TET）的方法。
　　方法：采用硅膠柱層析，葡聚糖凝膠柱層析，高速逆流色譜法對(duì)粉防己中的粉防己堿進(jìn)行分離；采用超高效液相色譜檢測(cè)其純度；采用核磁共振氫譜（1HNMR）和核磁共振碳譜（13CNMR）確定化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：分離得到一個(gè)生物堿單體：粉防己堿，峰面積歸一法計(jì)算其純度為99.3％。
　　結(jié)論：高速逆流

2、色譜與柱層析結(jié)合是有效的分離制備粉防己堿的方法。
　　第二部分 粉防己堿對(duì)人血淋巴細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響
　　目的：探究粉防己堿對(duì)人淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的影響，了解粉防己堿的免疫作用，對(duì)粉防己堿的預(yù)防性用藥做初步的探索與研究。
　　方法：（1）采用溴化二甲基噻唑二苯四唑法檢測(cè)終濃度為 1.0μg/ml、1.5μg/ml，2.0μg/ml，2.5μg/ml 的TET 對(duì)人淋巴細(xì)胞增殖的影響，檢測(cè)終濃度為 50μg/ml，

3、125μg/ml，250μg/ml的PHA及最優(yōu)的PHA 125μg/ml與不同濃度TET混合對(duì)人淋巴細(xì)胞增殖的影響，以只加培養(yǎng)液培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞作為對(duì)照，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。（2）用瑞氏吉姆薩染色觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)變化。（3）采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)IL-10、TNF-α和TGF-β抗體在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）TET在1.5μg/ml-2.5μg/ml的范圍內(nèi)顯著抑制人淋巴細(xì)胞的增殖(F=27.38，P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量

4、依賴(lài)性，1.0μg/ml TET對(duì)人淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用差異無(wú)顯著性；PHA在 50μg/ml-250μg/ml的范圍內(nèi)顯著抑制人淋巴細(xì)胞的增殖(F=4.31，P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性；PHA（125μg/ml）與不同藥物濃度的TET顯著抑制 人淋巴細(xì)胞的增殖(F=42.76，P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。（2）瑞氏吉姆薩染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明：與單獨(dú)采用1640培養(yǎng)基的比較，TET組、PHA（125μg/ml

5、）-TET組胞核縮小明顯，PHA組核質(zhì)增大明顯。細(xì)胞形態(tài)在二者的干預(yù)下變化顯著，TET能顯著干預(yù)PHA對(duì)人淋巴細(xì)胞的刺激作用；（3）免疫組化觀(guān)察細(xì)胞染色結(jié)果表明，TNF-α、TGF-β1和IL-10抗體在不同濃度TET作用下細(xì)胞中的表達(dá)均呈陽(yáng)性，定位于T、B細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在T、B細(xì)胞膜上呈陰性表達(dá)，在其他細(xì)胞呈陰性表達(dá)。TNF-α、TGF-β1和IL-10組與對(duì)照組比較，均有顯著差異（FTET=48.79，P<0.01；FTET=50.

6、39，P<0.01 ；F TET=31.32，P<0.01）。TNF-α、TGF-β1和IL-10 抗體在不同濃度PHA作用下細(xì)胞中的表達(dá)均呈陽(yáng)性，定位于T、B細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在T、B細(xì)胞細(xì)胞膜上呈陰性表達(dá)，在其他細(xì)胞呈陰性表達(dá)。TNF-α、TGF-β1和IL-10 組與對(duì)照組比較，均有顯著性差異（FPHA=16.43，P<0.01；FPHA=51.90，P<0.01；FPHA=33.73，P<0.01）。TNF-α、TGF-β1和IL-

7、10 抗體在PHA(125μg/ml)與不同濃度TET混合作用細(xì)胞中的表達(dá)均呈陽(yáng)性，定位于T、B細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在T、B細(xì)胞膜上呈陰性表達(dá)，在其他細(xì)胞呈陰性表達(dá)。TNF-α、TGF-β1和IL-10組與對(duì)照組比較，均有顯著差異（F TET-PHA=27.49，P<0.01；FTET-PHA=95.99，P<0.01；FTET-PHA=39.27，P<0.01）。
　　結(jié)論:（1）TET對(duì)淋巴細(xì)胞增殖有很強(qiáng)的抑制作用；（2）體外培養(yǎng)情