肝郁證模型大鼠海馬內(nèi)差異表達片段的初步生物信息學(xué)研究.pdf

1、證候以中醫(yī)藏象理論為基礎(chǔ)，又指導(dǎo)著中醫(yī)臨床診治的實施，是中醫(yī)理論的特色之一，因而成為近年來中醫(yī)研究的熱點。肝郁證是中醫(yī)肝病的主要證候，是臨床常見的證候之一，具有重要的研究意義。作為一類復(fù)雜證候，肝郁證表現(xiàn)不僅涉及肝本身病變，也關(guān)系到全身其它多臟腑系統(tǒng)的復(fù)雜病變。它可產(chǎn)生高級神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)機制紊亂，涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、免疫、感覺、運動等多系統(tǒng)多方面改變。 隨著目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)的研究

2、工作已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)中最為重要的研究方向。因此，利用這些技術(shù)研究證候理論是當前一熱點的方法。然而目前對肝郁證的研究大多數(shù)停留在部分已知基因表達產(chǎn)物(受體、酶、細胞因子以及肽類等)改變的層面上，并沒有針對肝郁證這一復(fù)雜證候做系統(tǒng)、整體的分析與整合，遠未揭示肝郁證的實質(zhì)。而證候的復(fù)雜表現(xiàn)應(yīng)有其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理，可能不是某一個或某幾個基因獨立發(fā)揮作用的結(jié)果，而是由于基因組整體水平上的調(diào)控發(fā)生紊亂所致。 基于上述認識，本文主要從以下方面進

3、行了研究：理論研究隨著后基因組時代的來臨，生命科學(xué)的研究重點已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)開始轉(zhuǎn)向功能基因組水平，這種更重視基因功能、更強調(diào)相互作用關(guān)系和整合的理念，與中醫(yī)的學(xué)術(shù)思想不謀而合。本文分別從整體觀、動態(tài)變化過程、功能性、個體化的角度對中醫(yī)的證候理論與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)之間的相似性做出了論述，力圖通過以上論述，充實證候?qū)W研究的手段和方法，使學(xué)者能從全新的角度和層面重新認定和評價中醫(yī)證候理論。 實驗研究實驗一肝郁證大鼠

4、動物模型的復(fù)制。 在前期實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究再次利用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激方法重復(fù)了肝郁證動物模型，并進行了1％蔗糖水攝取量的行為學(xué)測定。實驗進行了2次，實驗動物均使用SD雄性大鼠，隨機分為正常對照組(空白組)、應(yīng)激模型組(模型組)、應(yīng)激模型+阿米替林組(阿米替林組)，應(yīng)激模型+逍遙散組(逍遙散組)，采用慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激方法造模。造模第1天與第22天均測定了各組大鼠1小時1％蔗糖水攝取量。結(jié)果顯示：實驗初期，各組大鼠1％蔗

5、糖水攝取量經(jīng)統(tǒng)計組間無差異，實驗第22天，模型組1％蔗糖水攝取量明顯低于對照組；逍遙散組和阿米替林組攝取量則高于模型組，與對照組差異不顯著。肝郁證動物模型在行為學(xué)方面重復(fù)得到驗證。 實驗二生物信息學(xué)分析本部分對前期分離出的差異顯示片段(1號與12號)，進行了初步的生物信息學(xué)分析。首先通過UniGene數(shù)據(jù)庫進行ESTs聚類，利用軟件對ESTs進行拼接，完成序列的拼接之后，對重新組裝的contig進行功能注釋，注釋過程主要結(jié)合了以

6、下幾種方法：對新生序列進行Blastx檢索，如果匹配理想，則利用NCBI的數(shù)據(jù)庫對基因功能注釋；如果第一步驟中沒有理想的匹配，進行Blastn檢索，匹配理想則完成注釋；如果第二步驟中結(jié)果仍不理想，則利用用Interproscan進行蛋白質(zhì)功能域注釋；在以上三步完成后，可以進行一些后續(xù)的分析。例如用KEGG的數(shù)據(jù)庫對基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作出初步的整合；如果完成第一至第三步驟后，沒有理想的結(jié)果，可以初步認為是新的基因序列。分析結(jié)果顯示，1號片段與

7、12號片段分別代表了GSK3b與St3gal5這兩個基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；再進一步對GSK3b與St3gal5的功能加以研究分析后，提示這兩個基因有可能與肝郁證的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，機理有待進一步研究。 實驗三差異表達片段的反轉(zhuǎn)錄巢式PCR檢測通過反轉(zhuǎn)錄巢式PCR對前期實驗分離出的差異顯示片段進行了驗證，以發(fā)現(xiàn)與肝郁證密切相關(guān)的基因表達片段，并驗證實驗二部分的生物信息學(xué)分析，從而對肝郁證實質(zhì)和機理進行研究。造模方法同實驗一，動物造模末次處

8、理后，快速斷頭處死，冰上取腦，分離海馬，液氮凍存?zhèn)溆?。用Trizol試劑一步法提取模型大鼠海馬總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并針對前期實驗分離出的差異顯示片段設(shè)計引物，利用此引物與內(nèi)參(β-actin)引物進行雙管PCR擴增。擴增完成后，將PCR終產(chǎn)物測序以驗證PCR擴增的準確性，之后使用凝膠分析軟件對電泳圖片作灰度掃描，以目的片段/內(nèi)參作為相對表達量，分析比較四組相對表達量的高低。本次實驗對1號片段進行了驗證，實驗結(jié)果與前期D

9、DRT-PCR的結(jié)果基本吻合，可以認為1號片段模型組表達量高于空白組，至于阿米替林組表達量與空白組的關(guān)系，尚不能認為阿米替林組高于空白組。 綜上，逍遙散對慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激狀態(tài)下機體各方面功能變化具有調(diào)節(jié)作用，以方測證，我們可以初步認為.慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激狀態(tài)時機體功能的變化與中醫(yī)學(xué)的肝郁證更加接近。海馬是逍遙散調(diào)節(jié)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激的重要作用部位，眾多基因參與了逍遙散對慢性應(yīng)激的調(diào)節(jié)，有關(guān)其具體功能和機理還需要深入研究。