團(tuán)頭魴鋅的營(yíng)養(yǎng)需求及鋅對(duì)其精巢發(fā)育影響的研究.pdf

1、鋅(Zn)是維持魚(yú)類(lèi)正常生長(zhǎng)、發(fā)育所必需的微量元素，它不僅參與機(jī)體的各種代謝而且還在骨骼發(fā)育、生殖、免疫、生物膜穩(wěn)定和基因表達(dá)等生理機(jī)能中擔(dān)負(fù)重要角色。飼料中Zn缺乏會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)緩慢、食欲減退、死亡率增高和骨骼受損，并影響免疫功能。Zn供給過(guò)量會(huì)增加飼料成本，影響鈣、鎂和鐵等元素的吸收利用，同時(shí)引起養(yǎng)殖水體中Zn含量增加。這不僅會(huì)影響?zhàn)B殖魚(yú)類(lèi)的攝食，而且對(duì)魚(yú)類(lèi)的存活構(gòu)成重大威脅。因此準(zhǔn)確掌握飼料中Zn元素的配比是保障養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)正常生長(zhǎng)和

2、減少養(yǎng)殖過(guò)程中Zn排放的關(guān)鍵措施之一。
　　團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，其魚(yú)種階段(50～122g)對(duì)Zn的需要量為184.85 mg/kg。20世紀(jì)末，朱雅珠等采用L16(45)正交法研究了團(tuán)頭魴幼魚(yú)(4.9～18.6g)對(duì)Zn的需要量為20 mg/kg。鑒于已有的2篇報(bào)道中團(tuán)頭魴對(duì)Zn的需要量差異較大，因此本論文研究了鋅(Zn)對(duì)幼魚(yú)和成魚(yú)階段的團(tuán)頭魴(Megalobra

3、ma amblycephala)生長(zhǎng)性能、飼料利用、抗氧化指標(biāo)、基礎(chǔ)生化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)成分和精巢發(fā)育等的影響，以期確定幼魚(yú)和成魚(yú)階段的團(tuán)頭魴對(duì)飼料Zn的需要量;應(yīng)用RNA-seq檢測(cè)分析了團(tuán)頭魴幼魚(yú)(用含不同Zn含量的飼料飼喂10w)的精巢轉(zhuǎn)錄情況，以期了解Zn調(diào)控精巢發(fā)育的分子機(jī)制;應(yīng)用核磁共振技術(shù)(1H-NMR)檢測(cè)分析了團(tuán)頭魴幼魚(yú)(用含不同Zn含量的飼料飼喂12w)血清代謝物變化，以期發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴的Zn敏感生物標(biāo)志物。具體研究結(jié)果如下:

4、
　　1.團(tuán)頭魴幼魚(yú)對(duì)飼料Zn的需要量
　　以酪蛋白和明膠為蛋白源，七水硫酸Zn(ZnSO4·7H2O)為Zn源，分別配制成7種Zn含量(7.4、20.3、32.1、51.0、84.4、169.7和332.4 mg/kg)的半純化飼料，投喂初始體質(zhì)量為（3.6±0.1）g團(tuán)頭魴12w，考察Zn對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和抗氧化功能的影響，確定團(tuán)頭魴幼魚(yú)對(duì)飼料Zn的需要量。結(jié)果表明，隨著飼料Zn含量增加，團(tuán)頭魴增重率、

5、特定生長(zhǎng)率和全魚(yú)Zn含量呈先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì);全魚(yú)水分含量顯著降低(P＜0.05），粗蛋白含量顯著增加(P＜0.05)。飼料Zn含量對(duì)團(tuán)頭魴飼料系數(shù)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。飼料中添加Zn顯著影響血清總蛋白、尿素氮、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇以及甘油三酯含量，而對(duì)血清白蛋白含量和堿性磷酸酶活性無(wú)顯著影響。隨著飼料中Zn含量的增加，團(tuán)頭魴肝丙二醛含量顯著降低(P＜0.05)，而肝過(guò)氧化氫酶和超氧化歧化酶活性在各處理間均無(wú)顯著差異（P＞

6、0.05）。折線回歸分析表明:團(tuán)頭魴幼魚(yú)(3.6～26.7g)獲得最佳生長(zhǎng)時(shí)對(duì)飼料Zn需要量為32.6 mg/kg，獲得最大魚(yú)體Zn含量時(shí)Zn的需要量為47.6 mg/kg。通過(guò)延長(zhǎng)養(yǎng)殖時(shí)間，48 w時(shí)7.4 mg/kg組約有20％的實(shí)驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)脊柱彎曲、鰓蓋外翻、臀鰭和尾鰭不完整癥狀中的一種或多種癥狀。
　　2.團(tuán)頭魴成魚(yú)對(duì)飼料Zn的需要量
　　為考察團(tuán)頭魴成魚(yú)對(duì)飼料中Zn的需要量，以七水硫酸Zn(ZnSO4·7H2O)為Z

7、n源，配制Zn含量分別為7.8（對(duì)照組），32.7，50.3，87.2，165.4和328.5 mg/kg的6組等氮等脂飼料，分別飼喂初始體重為(128.60±0.74)g的團(tuán)頭魴，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)15尾魚(yú)，養(yǎng)殖12w。結(jié)果顯示，隨著飼料Zn含量增加，團(tuán)頭魴的增重率和全魚(yú)Zn含量先顯著升高，在Zn含量分別達(dá)到50.3 mg/kg和87.2 mg/kg后趨于穩(wěn)定。飼料中添加Zn降低了飼料系數(shù)，但各添加組間并無(wú)顯著差異。飼料中添

8、加Zn對(duì)全魚(yú)粗蛋白含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但顯著降低了全魚(yú)水分含量，提高了全魚(yú)灰分含量(P＜0.05)。飼料中添加Zn顯著影響肝臟丙二醛含量、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、總抗氧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，對(duì)血清葡萄糖、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），但顯著提高堿性磷酸酶活性并降低甘油三脂含量(P＜0.05)。肝臟組織石蠟切片顯示7.8 mg/kg和328.5 mg/kg組肝細(xì)胞出現(xiàn)核偏移，肝細(xì)胞的

9、細(xì)胞質(zhì)減少，出現(xiàn)了空泡現(xiàn)象。以增重率和全魚(yú)Zn含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)折線回歸分析得出，以ZnSO4·7H2O為Zn源時(shí)，團(tuán)頭魴成魚(yú)對(duì)飼料中Zn的需要量分別為52.1和86.2 mg/kg。Zn含量不足時(shí)會(huì)對(duì)團(tuán)頭魴成魚(yú)的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，但添加量過(guò)高(328.5 mg/kg)會(huì)引起肝臟損傷，降低抗氧化功能。
　　3.飼料Zn對(duì)團(tuán)頭魴成魚(yú)精巢發(fā)育的影響
　　本研究觀察了團(tuán)頭魴成魚(yú)對(duì)鋅需要量養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)魚(yú)的精巢切片及精子活力。

10、精巢組織石蠟切片顯示，各組精巢中均有發(fā)育成熟的精子，7.8和32.7 mg/kg組染色偏淡，其余四組顏色較深。7.8 mg/kg組的間質(zhì)組織不發(fā)達(dá)，50.3、87.2、165.4和328.5 mg/kg四組間質(zhì)組織較發(fā)達(dá)，其中分布的間質(zhì)細(xì)胞核仁明顯，核大而且圓。團(tuán)頭魴成魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)方面，Zn含量對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性和精子運(yùn)動(dòng)的前向性影響不顯著，但顯著影響精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、平均直線運(yùn)動(dòng)速度、精子的平均路徑速度、精子頭側(cè)擺幅度、精子平均

11、鞭打頻率、精子運(yùn)動(dòng)的直線性和精子平均移動(dòng)角度等參數(shù)(P＜0.05)。隨著飼料Zn含量的升高、團(tuán)頭魴成魚(yú)精子精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、平均直線運(yùn)動(dòng)速度、精子的平均路徑速度、精子頭側(cè)擺幅度、精子運(yùn)動(dòng)的直線性和精子平均移動(dòng)角度先顯著升高后下降(P＜0.05）精子平均鞭打頻率則隨著Zn含量升高呈下降趨勢(shì)，50.3、87.2、165.4和328.5 mg/kg組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明飼料中Zn含量不足時(shí)會(huì)延緩團(tuán)頭魴成魚(yú)精巢發(fā)育，

12、但添加量過(guò)高(328.5 mg/kg)會(huì)引起精子活力下降。
　　4.飼料鋅對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)精巢發(fā)育影響的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　本研究通過(guò)用3種Zn含量（8.5、30.9、328.1 mg/kg，分別記為ZN_L、ZN_M和Z_H)的飼料飼養(yǎng)初始體質(zhì)量為1.7g的團(tuán)頭魴幼魚(yú)10w，應(yīng)用RNA-seq檢測(cè)分析了三組實(shí)驗(yàn)魚(yú)精巢的轉(zhuǎn)錄情況，以期了解Zn調(diào)控團(tuán)頭魴幼魚(yú)精巢發(fā)育的分子機(jī)制。結(jié)果表明:三個(gè)轉(zhuǎn)錄本共組裝出67497Unigenes個(gè)

13、，其中35999個(gè)Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG/KOG四大數(shù)據(jù)庫(kù)中被成功注釋。組裝出來(lái)的Unigenes與斑馬魚(yú)參考基因組的匹配率最高達(dá)39.71％(26798個(gè)Unigenes)。在三個(gè)處理組之間一共有39963個(gè)差異表達(dá)基因。其中34122個(gè)基因在ZN_M和ZN_L中差異表達(dá)(20200個(gè)上調(diào)基因和13922個(gè)下調(diào)基因);22875個(gè)基因在ZN_M和ZN_H組中差異表達(dá)(19763個(gè)上調(diào)基因和311

14、2個(gè)下調(diào)基因);以及有30315個(gè)基因在ZN_H和ZN_L組中差異表達(dá)(18294個(gè)上調(diào)基因和12021個(gè)下調(diào)基因)。差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別主要包括單組織過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、生長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程和生物學(xué)過(guò)程調(diào)控等。差異基因所在的30條KEGG信號(hào)通路發(fā)生了顯著性表達(dá)變化。信號(hào)通路主要包括神經(jīng)活性的配體-受體相互作用、氧化磷酸化、核糖體生物合成、RNA聚合酶、核苷酸切除修復(fù)、DNA復(fù)制、細(xì)胞粘附分子、補(bǔ)體系統(tǒng)、腸道免疫IgA生成網(wǎng)絡(luò)、

15、造血細(xì)胞系等。以上結(jié)果顯示Zn可以誘導(dǎo)精巢發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)團(tuán)頭魴性腺細(xì)胞的增殖具有正調(diào)控作用，能夠促進(jìn)性腺的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，可用于解釋飼料Zn對(duì)團(tuán)頭魴雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制。
　　5.基于1H NMR技術(shù)的團(tuán)頭魴幼魚(yú)血清代謝組學(xué)分析
　　以1H NMR代謝組技術(shù)測(cè)試比較了用Zn含量為7.4、32.1和332.4 mg/kg飼料喂養(yǎng)12w團(tuán)頭魴的血清代謝物，對(duì)血清中的51種代謝物進(jìn)行了定性

16、和定量，其中氨基酸及其衍生物22種，糖類(lèi)3種、維生素5種和其它組分2種，經(jīng)PCA-LS和VIP分析，差異代謝物依次為脯氨酸、乳酸、葡萄糖、丙氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酰胺、肌酸、羥脯氨酸、?；撬?、絲氨酸、τ-甲基組氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和甘露糖。其中脯氨酸指標(biāo)反映Zn缺乏和過(guò)量都會(huì)對(duì)團(tuán)頭魴產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性應(yīng)激，乳酸則反映了肝功能狀況，葡萄糖反映了團(tuán)頭魴糖代謝狀況。以上結(jié)果顯示:脯氨酸、乳酸和葡萄糖可以作為反映團(tuán)頭魴Zn營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的潛在生物標(biāo)志物，