胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型的建立及相關(guān)神經(jīng)毒性研究.pdf

1、研究背景:
　　近10年來，臨床回顧性分析研究已經(jīng)證實，新生兒及嬰幼兒早期接受全身麻醉和鎮(zhèn)靜，可引起隨后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，包括學習能力下降、認知功能減弱等。這一結(jié)果，不僅引起醫(yī)療專家的關(guān)注，也引起了管理者和患兒家長的廣泛重視。尤其，隨著孕期婦女非產(chǎn)科手術(shù)比例的增加(0.15％-2％)，全身麻醉是否會影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，導致出生后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，成為臨床麻醉關(guān)注的熱點問題。
　　靜脈麻醉藥物丙泊酚（又名異丙酚，英文名

2、稱Propofol，化學名2，6-二異丙基苯酚）因起效迅速、代謝快而完全、蘇醒快而平穩(wěn)、不良反應少等優(yōu)點被廣泛應用于各類手術(shù)的全麻誘導和維持中，尤其適用于嬰幼兒手術(shù)麻醉、氣管插管、內(nèi)鏡檢查等操作和ICU的鎮(zhèn)靜。然而，與其他麻醉藥物的神經(jīng)毒性作用相似，研究發(fā)現(xiàn)，早期接觸丙泊酚也可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)元細胞凋亡，導致長期的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如學習、認知能力下降。進一步研究還證實，丙泊酚可影響突觸的形成過程，通過影響樹突棘的形態(tài)和濃度，突

3、觸結(jié)構(gòu)的數(shù)量來改變神經(jīng)信號的傳導，最終導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形，出現(xiàn)行為的異常。目前關(guān)于丙泊酚對mbp和syn2a基因及蛋白表達影響的研究較少，尤其是胚胎期丙泊酚暴露，是否會通過影響mbp、syn2a基因和蛋白的表達導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙？為解決這一疑問，需要更多的研究探討丙泊酚暴露對mbp和syn2a基因及蛋白表達的影響及相關(guān)的分子機制。
　　由于哺乳動物胚胎宮內(nèi)發(fā)育的特點，目前較少有丙泊酚對活體胚胎期生物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的文獻報道，

4、因此，需要建立新的動物模型，探討胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用。憑借斑馬魚模式動物的諸多優(yōu)勢，本研究通過建立胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型，探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育的神經(jīng)毒性作用，包括對胚胎發(fā)育生存率、孵化率和畸形率的影響;對胚胎細胞凋亡的影響及對mbp和syn2a基因及蛋白表達的影響。研究成果，不僅能為基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，更重要的是可為臨床應用提供重要參考，為如何安全有效的開展孕婦及新生兒、嬰幼兒麻醉工作，提供科學依據(jù)。

5、
　　研究目的:
　　1.建立胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型;
　　2.探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育過程中生存率、孵化率和畸形率的影響及對7dpf幼魚腦組織結(jié)構(gòu)的影響;
　　3.探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎及幼魚細胞凋亡的影響及相關(guān)的分子制;
　　4.探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚mbp和syn2a基因及蛋白表達的響。
　　研究內(nèi)容與方法:
　　1.建立胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型
　

6、　目前，尚無采用斑馬魚研究丙泊酚神經(jīng)毒性作用的相關(guān)文獻報道，因此，本研究的第一部分內(nèi)容是建立斑馬魚胚胎丙泊酚暴露模型。以受精后的斑馬魚胚胎和幼魚為研究對象，通過檢測不同時間和不同濃度丙泊酚暴露下，胚胎發(fā)育孵化率、畸形率和生存率的變化來確定合理的暴露濃度和時間。具體內(nèi)容如下:
　　1)為確定斑馬魚胚胎丙泊酚暴露濃度和暴露時間，將受精后6-48小時(6-48hpf，hours post-fertilization)的胚胎浸泡于含不同濃

7、度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、9μg/ml）和含相同劑量DMSO（丙泊酚溶劑，0.013％）及空白對照幼魚孵化水中。24hpf時將各組受試液均更新一半（含丙泊酚和DMSO溶液），48hpf全部更換為孵化水。
　　2)為檢測胚胎期丙泊酚暴露的一般毒性作用，分別在24、48、72、96和120hpf時，記錄各實驗組胚胎生存率、孵化率、畸形率以及畸形特征。
　　3)為檢測胚胎期丙泊

8、酚暴露對腦部發(fā)育的影響，取暴露后7dpf(days post-fertilization)幼魚，通過HE染色檢測其腦部細胞數(shù)量和腦室腔的變化。
　　4)為檢測丙泊酚的麻醉效果，取健康6dpf幼魚分別浸泡于含不同濃度丙泊酚（1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml）、含相同劑量DMSO(0.013％)及空白對照養(yǎng)魚水中，浸泡30min后全部更換為新鮮養(yǎng)魚水，觀察24h。通過記錄各組幼魚麻醉起效時間、復蘇時間及死亡率來評價丙泊酚的麻醉

9、效應。
　　2.檢測胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用
　　哺乳類動物實驗研究已經(jīng)證實，出生后早期丙泊酚暴露可以引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)細胞凋亡。因此，胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型建立成功后，第二部分研究內(nèi)容就是檢測胚胎期丙泊酚暴露對細胞凋亡的影響及可能的分子機制。同時，進一步探討了胚胎期丙泊酚暴露對mbp和syn2a基因及蛋白表達的影響。具體內(nèi)容如下:
　　1)為檢測胚胎期丙泊酚暴露的促細胞凋亡作用，取暴露后36hpf胚胎

10、，通過整體吖啶橙染色，比較各組胚胎整體凋亡細胞數(shù)量的變化。
　　2)為檢測丙泊酚促細胞凋亡作用的機制，取暴露后36hpf胚胎，通過qRT-PCR檢測凋亡信號傳導通路相關(guān)基因caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表達的變化。
　　3)為檢測丙泊酚對孵化后幼魚的神經(jīng)毒性作用，取經(jīng)暴露后3dpf幼魚，通過整體吖啶橙染色，比較各組幼魚腦部凋亡細胞的變化。
　　4)為檢測丙泊酚對孵化后幼魚的神經(jīng)毒性

11、作用，取經(jīng)暴露后3dpf幼魚，通過 qRT-PCR、整體原位雜交技術(shù)和western blots法，分析mbp和syn2a基因及蛋白表達的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.1 2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚神經(jīng)毒性作用的最佳濃度。
　　2.1 2、3μg/ml丙泊酚具有麻醉效果。
　　3.丙泊酚可影響7dpf幼魚腦組織結(jié)構(gòu)
　　比較經(jīng)胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露，發(fā)育至7dpf魚的腦部組織結(jié)

12、構(gòu)可見，與對照組相比，丙泊酚處理組幼魚腦組織結(jié)構(gòu)腔隙增大，細胞數(shù)量減少。提示，胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚腦部發(fā)育具有毒性作用。
　　4.丙泊酚可誘導36hpf胚胎細胞凋亡增加，上調(diào)caspase-3、-8和-9 mRNA表達
　　研究已經(jīng)證實，丙泊酚可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)元細胞凋亡，那么對于斑馬魚是否具有相同的作用呢？本研究顯示:在對照組中，36hpf胚胎整體未見明顯的凋亡細胞信號;在1、2、3μg/ml丙泊酚組，在胚胎頭

13、部、尾部均可見凋亡細胞，數(shù)量明顯增多。
　　Caspase家族參與的信號傳導通路是啟動細胞凋亡程序的重要機制之一，其中caspase-3、caspase-8和caspase-9在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，丙泊酚暴露組胚胎體內(nèi)caspase-3、-8、-9 mRNA表達均顯著增高(P＜0.05)。進一步分析還發(fā)現(xiàn)，caspase-8和caspase-9在三個劑量丙泊酚暴露組的表達呈劑量依賴性上調(diào)(P＜0.05)

14、。以上結(jié)果提示，胚胎期丙泊酚暴露引起的促細胞凋亡作用可能與caspase信號通路的激活有關(guān)，且丙泊酚的神經(jīng)毒性作用隨著藥物濃度的增高而增強。
　　5.丙泊酚可誘導3dpf幼魚腦部細胞凋亡增多
　　3dpf是斑馬魚胚胎孵化為幼魚的關(guān)鍵時期，為檢測丙泊酚促細胞凋亡作用的持續(xù)性，本研究分析了3dpf幼魚腦組織中凋亡細胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，與對照相比，丙泊酚暴露組腦部凋亡細胞的數(shù)量顯著增多(P＜0.05)。并且，3μg/ml丙泊酚

15、暴露組腦部凋亡細胞數(shù)量高于1μg/ml丙泊酚暴露組(P＜0.05)。提示丙泊酚的促細胞凋亡作用具有持續(xù)性，且隨著藥物濃度的增高而增強。
　　6.丙泊酚可下調(diào)mbp mRNA及蛋白的表達
　　Mbp和syn2a基因是突觸形成過程中發(fā)揮重要作用的兩種基因。然而，目前很少有研究探討丙泊酚對此兩種基因表達的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露后，各組3dpf幼魚mbp mRNA表達顯著下降(P＜0.05)。通過整

16、體原位雜交法發(fā)現(xiàn)，mbp mRNA下調(diào)程度可分為三個級別:無變化、輕度下降和嚴重下降。整體原位雜交結(jié)果還顯示，mbp mRNA表達的下降主要表現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，外周神經(jīng)系統(tǒng)的表達無顯著差異。Mbp蛋白檢測也顯示一致結(jié)果，與對照組相比，丙泊酚暴露組幼魚Mbp蛋白的表達呈劑量依賴性下降(P＜0.05)。然而，分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，丙泊酚暴露組幼魚syn2a基因mRNA的表達無顯著差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.

17、將6-48hpf斑馬魚胚胎通過浸泡方式暴露于含1、2、3μg/ml丙泊酚幼魚孵化水中，是研究胚胎期丙泊酚暴露神經(jīng)毒性作用的最佳動物模型;
　　2.胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育具有毒性作用，表現(xiàn)為:延遲胚胎孵化的時間，引起胚胎發(fā)育的畸形及影響腦組織結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育;
　　3.胚胎期丙泊酚暴露可引起胚胎整體細胞凋亡增多，且細胞凋亡的發(fā)生可能與caspase-3、-8、-9參與的信號通路的激活有關(guān)。
　　4.胚胎期丙泊酚暴