膽鹽脂質(zhì)體促進(jìn)胰島素口服吸收的研究.pdf

1、脂質(zhì)體口服給藥具有一定的促進(jìn)蛋白多肽藥物吸收的作用，但普通脂質(zhì)體在體內(nèi)容易受到膽鹽的破壞，并且難以穿透生物膜，限制了其在口服給藥方面的應(yīng)用。含有膽鹽的脂質(zhì)體，由于膽鹽的作用，使脂質(zhì)體胃腸道的穩(wěn)定性得以改善，在口服粘膜免疫方面得到很好的應(yīng)用。本文擬以胰島素為模型藥物，利用膽鹽脂質(zhì)體的促進(jìn)吸收作用來提高蛋白多肽類藥物的口服生物利用度，并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　針對胰島素在脂質(zhì)體中包封率低的特點，本文采用逆向蒸發(fā)/高壓均質(zhì)法制備胰島

2、素脂質(zhì)體，首先以包封率和粒徑為指標(biāo)，對制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、磷脂/膽鹽比、藥/脂比、內(nèi)水相pH、外水相離子強(qiáng)度、初乳相體積比以及水化時間等影響因素。最優(yōu)處方的胰島素包封率為30±2％，脂質(zhì)體粒徑為154±18nm。圓二色譜檢測結(jié)果表明在各種極端制備條件下制備的脂質(zhì)體，胰島素的二級構(gòu)象保持完好，α螺旋含量和θ208/θ223值均與胰島素溶液十分接近;小鼠皮下降糖實驗表明，制劑中胰島素的降糖作用與胰島素溶液無顯著

3、性差異。本文的制備條件對胰島素的二級構(gòu)象和生物活性無影響，。
　　在制備工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，本文分別制備了胰島素的甘氨膽酸鹽脂質(zhì)體(SGC-liposomes)、?；悄懰猁}脂質(zhì)體(STC-liposomes)、脫氧膽酸鹽脂質(zhì)體(SDC-liposomes)和普通脂質(zhì)體，在體外對其性質(zhì)進(jìn)行了表征，正常大鼠和糖尿病大鼠模型上對膽鹽脂質(zhì)體的降糖作用及生物利用度進(jìn)行了研究。為了逐步揭示膽鹽脂質(zhì)體促進(jìn)胰島素口服吸收的機(jī)制，本文中首先比較了不含

4、不同膽鹽的脂質(zhì)體、不同粒徑大小的脂質(zhì)體和不同的給藥劑量對胰島素口服吸收的影響。透射電鏡觀察表明膽鹽脂質(zhì)體的外觀為類球形，而普通脂質(zhì)體則較為圓整，這可能與膽鹽脂質(zhì)體膜柔性大有關(guān)。體外6個小時的泄漏實驗表明，膽鹽脂質(zhì)體在pH2，5.6和6.8的環(huán)境里比較穩(wěn)定，泄漏較緩慢，包封率基本不變。圓二色譜檢測及小鼠皮下降糖實驗表明，包載在三種膽鹽脂質(zhì)體中的胰島素活性保持完好。大鼠口服三種膽鹽脂質(zhì)體后，都有一定程度的降糖作用，而口服胰島素溶液、胰島素與

5、甘膽酸鹽的混合液、空白膽酸鹽脂質(zhì)體制劑和胰島素與空白膽酸鹽脂質(zhì)體制劑則沒有降糖作用。比較不同膽鹽脂質(zhì)體的降糖水平發(fā)現(xiàn)，以甘膽酸鹽脂質(zhì)體的效果最佳，最大降糖百分?jǐn)?shù)63％，持續(xù)降糖20個小時左右。不同粒徑的膽鹽脂質(zhì)體達(dá)峰時間和藥效持續(xù)時間不同，小粒子的達(dá)峰時間快，但藥效持續(xù)時間短，大粒子則恰好相反;粒子太大，如2000nm則無降血糖作用。考察不同濃度對降糖效果的影響發(fā)現(xiàn)，在2～20 IU/Kg的給藥劑量內(nèi)，降糖效果和血藥濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系

6、，血糖曲線上面積AAC和藥時曲線下面積AUC均與濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r≈0.9.糖尿病大鼠口服各個制劑和對照制劑后，降糖作用明顯，趨勢與正常大鼠相似，其中以甘膽酸鹽脂質(zhì)體的降糖作用最強(qiáng)，最大降糖百分?jǐn)?shù)達(dá)55％，持續(xù)降糖24個小時左右，PA和F分別為10.2％和9.9％。
　　體外抗酶降解的實驗說明，在4小時內(nèi)，膽鹽脂質(zhì)體能有效保護(hù)胰島素減少胃蛋白酶、胰蛋白酶和α糜蛋白酶對它的降解，效果明顯好于普通脂質(zhì)體。其中以甘膽酸鹽脂質(zhì)體的保

7、護(hù)作用最佳，三種酶中4個小時胰島素存留百分含量分別為最初的48％、67％和81％;隨著膽鹽在脂質(zhì)體總脂質(zhì)中比例的增加，保護(hù)作用減弱，這可能與膽鹽增加了藥物的泄漏有關(guān)。
　　大鼠口服近紅外探針I(yè)R783標(biāo)記的胰島素脂質(zhì)體，在胃腸道存在的時間與抗酶降解能力有關(guān)，抗酶降解能力強(qiáng)的，胃腸道存在時間久，入血胰島素濃度大。甘膽酸鹽脂質(zhì)體在胃腸道內(nèi)保留時間最久，血藥濃度最大，普通脂質(zhì)體15分鐘后即有大量胰島素被降解。
　　Caco-2細(xì)胞

8、對脂質(zhì)體的攝取可被膽鹽大大促進(jìn)，并且胰島素有可能是以載藥脂質(zhì)體整體被攝取，空白脂質(zhì)體和甘膽酸鹽本身不能促進(jìn)細(xì)胞對胰島素的攝取。細(xì)胞對膽鹽脂質(zhì)體的攝取與粒徑相關(guān)，400 nm以下的小粒子細(xì)胞攝取量較多，2000 nm的大粒子幾乎不被細(xì)胞攝取。細(xì)胞攝取量還與濃度呈正相關(guān)，制劑濃度越高，細(xì)胞攝取量越大。
　　膽鹽脂質(zhì)體與Caco-2細(xì)胞作用后能迅速打開細(xì)胞的緊密連接，并促進(jìn)胰島素跨細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)，顯著優(yōu)于普通脂質(zhì)體。甘膽酸鹽脂質(zhì)體的滲透系

9、數(shù)Papp4.79±0.55×10-6，是普通脂質(zhì)體的近3倍。粒徑大小對轉(zhuǎn)運(yùn)有影響，隨著粒徑的減小，跨膜電阻值下降更多，藥物累積透過量更大，2000nm的粒子基本無轉(zhuǎn)運(yùn);制劑濃度對細(xì)胞的跨膜電阻和Papp影響較小，隨著濃度增大，藥物累計透過量增加。激光共聚焦顯微鏡觀察膽鹽脂質(zhì)體孵育2h后的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肌動蛋白縮短，ZO-1蛋白斷裂，而普通脂質(zhì)體和胰島素溶液作用后的細(xì)胞與正常細(xì)胞無明顯差別。
　　比較不同膽鹽類型和不同濃度的制劑對細(xì)胞

10、存活率和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)在1～25 mM濃度范圍內(nèi)的三種膽鹽脂質(zhì)體，對細(xì)胞存活率基本無影響，4個小時MTT實驗表明細(xì)胞存活率下降很小;Annexin V FITC/PI法檢測，制劑對細(xì)胞24小時的凋亡誘導(dǎo)率基本為0.初步安全性實驗表明，膽鹽脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性比較小。
　　綜上所述，膽鹽脂質(zhì)體作為胰島素口服遞送的載體，能夠有效地促進(jìn)胰島素的口服吸收，糖尿病大鼠口服生物利用度PA和F分別達(dá)到10.2％和9.9％;膽鹽脂質(zhì)體口服后能有效