腦膠質(zhì)瘤組織中惡性程度相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析與鑒定.pdf

1、研究背景:
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見且最難治的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率以及低治愈率的特點(diǎn)，預(yù)后較差。低度惡性膠質(zhì)瘤（WHOⅠ-Ⅱ級）的平均存活時間是3～5年，而高度惡性膠質(zhì)瘤(WHOⅢ-Ⅳ級)的平均存活時間是1～2年，而總體手術(shù)后5年生存率約為6％左右。目前膠質(zhì)瘤的術(shù)前定性診斷和復(fù)發(fā)檢測的方法主要依賴影像學(xué)檢查，臨床診斷和治療方案絕大部分基于組織病理學(xué)的診斷，且高度依賴于神經(jīng)病理學(xué)家

2、的主觀判斷;此外，膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性和高度浸潤特性經(jīng)常會造成大量的診斷差異，影像學(xué)、相關(guān)癌基因或腫瘤標(biāo)記物的檢測對術(shù)前估計腫瘤惡性程度都存在假陽性率及假陰性率高的問題，因此膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療方面面臨極大的挑戰(zhàn)。盡管目前的研究表明膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多基因的變化，如抑癌基因的功能喪失、癌基因的活化等，并經(jīng)歷多階段、多步驟的進(jìn)展過程，但膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的詳盡分子機(jī)制并不十分清楚，目前仍缺乏膠質(zhì)瘤特異的分子標(biāo)記物，因而分析與鑒定膠質(zhì)瘤高特異

3、性、高敏感性的生物標(biāo)志物迫切且必要。蛋白質(zhì)組學(xué)是指對整個基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的研究，通過分析鑒定細(xì)胞、組織或機(jī)體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，提供一組蛋白質(zhì)的功能及其表達(dá)模式的信息，能夠反映細(xì)胞內(nèi)部的遺傳特性和外界因素共同作用的結(jié)果，因此深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，鑒定膠質(zhì)瘤特異的生物標(biāo)記物，客觀上需要在蛋白質(zhì)組的水平進(jìn)行進(jìn)一步的探索。由于腫瘤組織能夠直接或間接的產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物，因此通過研究腫瘤組織成為篩選腫瘤標(biāo)志物最直接有

4、效的途徑。
　　 研究目的:
　　 篩選與鑒定正常腦組織和惡性程度不同的膠質(zhì)瘤組織蛋白表達(dá)差異譜，尋找早期定性診斷和復(fù)發(fā)檢測的腫瘤標(biāo)志物，為膠質(zhì)瘤的分子個體診斷和分子靶向治療奠定了重要理論基礎(chǔ)，增進(jìn)理解膠質(zhì)瘤多階段發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.研究對象
　　 收集2009-2010年在我院神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本52例，其中WHOⅡ級23例，WHOⅢ級15例，WHOⅣ級14例，所

5、有標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)病理檢查證實。另收集同期住院的需手術(shù)切除正常腦組織的12例腦外傷患者的腦組織為對照（正常腦組織組）。
　　 2.組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)
　　 按照世界衛(wèi)生組織(WHO)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分級標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級為良性腫瘤，Ⅱ級代表低度惡性，Ⅲ級為惡性腫瘤，Ⅳ級提示高度惡性。所有膠質(zhì)瘤組織都經(jīng)過我院3名神經(jīng)病理學(xué)專家確認(rèn)。
　　 3.蛋白質(zhì)組學(xué)方法
　　 3.1組織蛋白的提取及濃度測定
　　 新鮮手術(shù)標(biāo)

6、本切碎，加入適量組織蛋白裂解液后在冰上勻漿，16×1000rpm離心15分鐘，棄去沉淀中不溶組織和細(xì)胞殘渣及碎片，上清液即蛋白提取物。蛋白濃度的測定采用BCA法。
　　 3.2蛋白質(zhì)組的二維電泳(2-DE)、圖像分析、質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定
　　 雙向電泳的第一項，即等電聚焦采用BioRad的固相pH梯度干膠條(13cm的pH3-10非線性);第二項電泳采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色得到2-DE圖譜。銀

7、染后的蛋白2-DE圖譜經(jīng)ImageScancer(GE)掃描，圖像分析應(yīng)用ImageMaster。差異蛋白質(zhì)點(diǎn)應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI)和生物信息學(xué)軟件分析，檢索InternationalProteinIndex(IPI)人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，確定蛋白ID。
　　 4.免疫印跡
　　 對GFAP、HSP27、Peroxiredoxin1和CathepsinD蛋白進(jìn)行免疫印跡的驗證。一維電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將膠上的

8、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉非特異性的結(jié)合反應(yīng)，然后分別與相應(yīng)一抗孵育、化學(xué)發(fā)光法檢測。
　　 5.RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)
　　 應(yīng)用TRIzon（康為）提取手術(shù)組織的總RNA，并測定RNA的A260/A280值均在1.6-1.8之間，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行pCD和內(nèi)參β-actin特異擴(kuò)增。
　　 6.免疫組織化學(xué)方法（ABC法）檢測pCD在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)
　　 石蠟切片脫蠟、梯度

9、酒精、抗原修復(fù)，3mL/LH2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，1∶50的正常馬血清室溫孵育20min。pCD山羊多抗于濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過夜。生物素標(biāo)記的抗山羊二抗孵育45min，ABC(1∶1∶50)室溫孵育1h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2顯色。
　　 7.CDsiRNA介導(dǎo)的CD表達(dá)降低后體外細(xì)胞侵襲實驗檢測
　　 轉(zhuǎn)染48h后的U87細(xì)胞胰酶消化，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸U87細(xì)胞，調(diào)整U87細(xì)胞密度為1×10

10、5/ml，24孔板底部加入0.75ml的10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，插入元件內(nèi)加入含有U87細(xì)胞的無血清DMEM培養(yǎng)基0.5ml，37℃培養(yǎng)箱孵育24h后取出轉(zhuǎn)移小室，插入元件進(jìn)行福爾馬林固定、結(jié)晶紫染色、封片，顯微鏡下觀察計數(shù)，高倍鏡下(40X)隨機(jī)選取10個視野，計數(shù)穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)。
　　 8.統(tǒng)計分析
　　 所有標(biāo)本的二維電泳圖譜經(jīng)ImageMaster2-DElite分析得到標(biāo)準(zhǔn)化體積及差異后，采用SPSS

11、10.0軟件系統(tǒng)中單項的Student'st或ANOVA進(jìn)行了檢驗分析;對免疫組織化學(xué)結(jié)果采用SPSS10.0進(jìn)行x2檢驗，檢驗的水準(zhǔn)為0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.比較分析膠質(zhì)瘤Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級與正常腦組織，共檢測到20個明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中14個蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，6個蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)降低，差異倍數(shù)均在1.5倍以上，統(tǒng)計學(xué)分析表明均有顯著的差異(P＜0.05)。
　　 2.質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)處理

12、及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索后，共鑒定出15種差異表達(dá)的蛋白，其中10種蛋白的表達(dá)在Ⅲ和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中升高，包括Heatshockprotein27(HSP27)、Prohibitin、78-kDaglucose-regulatedprotein(GRP78)、Peroxiredoxin1、Peroxiredoxin6、AnnexinⅡ、CathepsinD(CD)、Plasminogenactivatorinhibitor-1、Actin(c

13、ytoplasmic1)、GlutathioneS-transferaseM(GSTM);在Ⅲ和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)降低的ProteindisulfideisomeraseA3(PDIA3)、Alpha-crystallinBchain、T-complexprotein1(εsubunit)、Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeL1、Glialfibrillaryacidicprotein

14、(GFAP)。
　　 3.免疫印跡結(jié)果表明:GFAP在正常腦組織中表達(dá)最高，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增高，GFAP表達(dá)逐漸降低，在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)最低;HSP27、Peroxiredoxin1的表達(dá)模式與GFAP完全相反，HSP27、Peroxiredoxin1在正常腦組織中表達(dá)極低，但在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯升高。在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中，可檢測到CathepsinD(CD)的成熟體和前體(Pro-cathepsinD，pCD)

15、，分子量分別為52kDa和34kDa;與成熟體CD相比，pCD在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中升高尤為顯著。
　　 4.pCDmRNA在Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯增高。
　　 5.pCD在正常的腦組織中僅見極少量的神經(jīng)細(xì)胞膜輕度黃染，正常的膠質(zhì)細(xì)胞染色陰性;在Ⅱ級膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜有少量黃染的顆粒，染色級別為+;在Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿中散在分布大量的棕黃色顆粒，pCD呈中度至強(qiáng)陽性表達(dá)。統(tǒng)計分析表明:與非膠質(zhì)瘤組織相比，Ⅱ級膠質(zhì)

16、瘤中pCD的表達(dá)明顯著增高(x2=2.873，P＜0.05);Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤分別與Ⅱ級膠質(zhì)瘤、非瘤組織比較，pCD表達(dá)顯著增高(x2=13.965，P＜0.05)。
　　 6.利用CDsiRNA技術(shù)沉默人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中CD的表達(dá)后，U87細(xì)胞增殖明顯減慢，同時U87中的CD沉默后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力亦顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究應(yīng)用以2-DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，共鑒定出15種與膠質(zhì)瘤惡性程