偏頭痛大鼠硬腦膜上Artemin表達變化參與偏頭痛病理發(fā)生過程.pdf

1、背景
　　 偏頭痛（migraine）是一種常見的致殘性原發(fā)性頭痛性疾病，表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)搏動性頭痛，呈反復發(fā)作性，影響了15％的世界人口。偏頭痛不僅嚴重干擾了患者的生活，還給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活導致硬腦膜無菌性炎癥是偏頭痛的發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)釋放致顱血管擴張，血漿蛋白外滲，肥大細胞脫顆粒使得促炎性物質(zhì)滲入到硬腦膜，進一步激活硬腦膜上的初級傳入纖維，引發(fā)疼痛發(fā)生。

2、　　 研究結(jié)果顯示，硬腦膜上顱血管外周三叉神經(jīng)的傷害性感受器的激活可以促使生物活性物質(zhì)的釋放，如神經(jīng)激肽A(Neurokinin A，NKA)，P物質(zhì)(SubstanceP, SP)，CGRP，膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line derived neurotrophicfactor，GDNF)，neurturin，persephin，Artemin等神經(jīng)肽類和神經(jīng)營養(yǎng)因子家族。這些生物介質(zhì)的產(chǎn)生能引發(fā)或調(diào)節(jié)疼痛發(fā)

3、生。Artemin(Artn)是膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，其信號通過GDNF家族受體(GFRα3)和Ret復合受體實現(xiàn)的。Artn表達于血管平滑肌細胞，能調(diào)節(jié)交感節(jié)后神經(jīng)元的發(fā)育及分布。國外學者研究外周組織發(fā)生炎癥時Artn的表達增加，注射Artn引起痛覺敏感組織的增敏效應。Artn可以易化傷害性感受器TRPV1信號在背根神經(jīng)節(jié)的傳遞，從而有助于炎癥引起的痛覺增敏的形成。目前研究顯示Artn的特異性受體GFRα3持續(xù)表達在交感節(jié)

4、后神經(jīng)元。交感神經(jīng)系統(tǒng)除了參與機體非隨意功能的控制來維持機體自身狀態(tài)的穩(wěn)定，而且參與了感覺過程，尤其是疼痛的產(chǎn)生或維持過程。研究還發(fā)現(xiàn)GFRα3亦表達在初級傳入纖維如三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)，其作為傷害性感受器在炎性痛覺增敏中起作用。GFRα3活性神經(jīng)元能表達傷害性神經(jīng)遞質(zhì)CGRP，和TRPV1，TRPV1通道在痛覺的產(chǎn)生及痛覺敏感性增強的病理發(fā)生過程中扮演著重要角色。進一步，激活TRPV1能夠促進CGRP的釋放，后者釋放后可以導致血管擴

5、張，神經(jīng)源性炎癥和肥大細胞的激活，參與頭痛的發(fā)生過程。以上說明Artn可能作為一傷害性感受器參與痛覺的發(fā)生和發(fā)展。
　　 目的
　　 近來樊忠教授采用手術(shù)結(jié)扎腦膜中動脈和/或顳淺動脈、巖淺大神經(jīng)切斷的方法治療頑固性偏頭痛，能明顯緩解患者偏頭痛癥狀。說明腦膜中動脈參與了偏頭痛的病理發(fā)生過程。本研究通過建立硝酸甘油致偏頭痛動物模型，研究偏頭痛大鼠硬腦膜上Artn表達的變化情況，以及通過阻斷腦膜中動脈后大鼠硬腦膜上Artn表達

6、變化，探討Artn在偏頭痛發(fā)病機制中的作用，旨在探討熱凝腦膜中動脈有效治療頑固性偏頭痛的確切機制，為頑固性偏頭痛手術(shù)價值的評估提供一定理論和實驗依據(jù)。
　　 方法
　　 健康雌性Wistar大鼠78只，250-300 g，隨機分為四組:生理鹽水組（A組，n=33只）:皮下注射生理鹽水(NS10mg/Kg)，作為對照組;硝酸甘油組(B組，n=33只):皮下注射硝酸甘油(NTG10mg/Kg)建立偏頭痛動物模型;手術(shù)組（C組

7、，n=6只）:熱凝腦膜中動脈后皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg;假手術(shù)組（D組， n=6只）:單純暴露腦膜中動脈后皮下注射硝酸甘油注射液10mg/kg（藥物注射部位均為同一側(cè)頸部皮下）。觀察各組大鼠行為學變化，以及造模成功后1h，2h，3h，4h，6h取硬腦膜檢測。應用雙重免疫熒光染色法定位Artn的表達;RT-PCR， Western blot及免疫組化檢測Artn mRNA及蛋白的表達變化情況。
　　 結(jié)果
　　

8、 Wistar大鼠頸部皮下注射硝酸甘油(10 mg/kg)后，A組大鼠偶爾出現(xiàn)撓頭現(xiàn)象，無煩躁不安的表現(xiàn)，B組和D組大鼠在注射后10 min左右，即出現(xiàn)爬籠次數(shù)增多，頻繁撓頭，理毛等煩躁不安表現(xiàn)，半小時后隨即出現(xiàn)蜷臥，活動減少等情況。C組大鼠與B、D組大鼠相比，撓頭及爬籠次數(shù)明顯減少且頻度降低，無煩躁不安等現(xiàn)象。雙重免疫熒光結(jié)果顯示Artn分泌并表達于在偏頭痛大鼠硬腦膜血管平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi)。生理鹽水組各時間點均有Artn基因和蛋白表達

9、，但各時間點的相對表達無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。硝酸甘油組Artn mRNA在2h時大量表達(1.5203±0.0477)，與對照組相比(0.4737±0.0264)差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，隨后表達量逐步下降，6h趨于正常對照組水平。硝酸甘油組Artn的蛋白在3h時較生理鹽水組開始增加，一直持續(xù)到6h，各時間點差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。選取注射藥物后6小時作為后續(xù)研究的時間點。注射硝酸甘油后大鼠硬腦膜Artn蛋

10、白的表達較生理鹽水組均增加(P＜0.05)，同時熱凝腦膜中動脈后Artn蛋白的表達較硝酸甘油組和假手術(shù)組明顯下降(P＜0.05)。但B與D兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 結(jié)論
　　 (1)皮下注射硝酸甘油能有效構(gòu)建偏頭痛大鼠實驗動物模型。
　　 (2)Artemin存在并表達于偏頭痛大鼠硬腦膜上腦膜中動脈的血管平滑肌細胞內(nèi)，參與偏頭痛病理發(fā)生過程。
　　 (3)阻斷MMA顯著減輕NTG誘