蒼耳子的生物活性成分及品質(zhì)評價.pdf

1、本課題選擇傳統(tǒng)中藥蒼耳子為研究對象，跟蹤篩選其抗炎作用的活性物質(zhì)，明確活性部位中主含酚酸類成分，并從中分離鑒定16個化合物，其中2個為新的噻嗪雙酮類化合物，同時從其他部位中分離鑒定17個化合物。對總酚酸部位和部分單體進(jìn)行相關(guān)藥效學(xué)研究，確證總酚酸(TPA)和部分單體具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏作用，總酚酸還對實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎和鼻竇炎具有治療作用；通過形態(tài)學(xué)觀察和數(shù)量分類學(xué)分析，深入研究國產(chǎn)蒼耳屬植物的種間差異和種內(nèi)變異，發(fā)現(xiàn)了一個特殊的蒼耳類

2、型，暫名為深圳型；采用高效液相色譜法，對蒼耳子類藥材的化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行研究，并以此為依據(jù)將國產(chǎn)蒼耳屬植物分為單咖型、雙咖型和深圳型；以活性成分為指標(biāo)化合物，同時測定30個產(chǎn)地蒼耳子藥材中5個活性成分的含量。我們建立的方法可以用來評價不同來源藥材的品質(zhì)，并為蒼耳子藥材的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 隨著工業(yè)化進(jìn)展和人類生態(tài)環(huán)境的急劇惡化，鼻炎、過敏性鼻炎等鼻科疾病的發(fā)病率有全球性增長的趨勢，致力于鼻病治療藥物的現(xiàn)代化研究和開發(fā)具有較大的現(xiàn)

3、實(shí)意義。利用中藥對治療復(fù)雜的鼻科疑難病癥的優(yōu)勢，通過闡明療效確切的傳統(tǒng)中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從有效成分或有效部位中研究開發(fā)中藥新藥更易于與國際接軌、進(jìn)入國際市場。蒼耳子(FructusXanthii)為菊科植物蒼耳XanthiumsibiriumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，為中國藥典品種，具有發(fā)汗、散風(fēng)濕、通鼻竅、止痛之功效，為歷代治療鼻病及頭痛的要藥。但是，目前對蒼耳子的化學(xué)成分、藥理活性等基礎(chǔ)研究嚴(yán)重不足，導(dǎo)致活性部位和活性成分

4、不明確以及沒有可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。蒼耳是一個廣布種，作為常用中藥在臨床上有相當(dāng)大的需求量，品種的混亂及質(zhì)量的參差不齊必將對該生藥的使用產(chǎn)生不利的影響。 因此，對蒼耳子進(jìn)行活性部位和活性成分的跟蹤篩選，以活性成分為指標(biāo)評價其品質(zhì)，并對國產(chǎn)蒼耳屬植物的種間差異和種內(nèi)變異進(jìn)行深入的研究，具有較高的可行性和實(shí)用性。本課題主要涵蓋以下幾方面內(nèi)容： 一、活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究 1.以二甲苯致小鼠耳腫脹模型，對蒼耳子75％乙醇提取，石油

5、醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取的各部位進(jìn)行抗炎活性跟蹤篩選，篩選出正丁醇部位(FD)為蒼耳子中的活性組分群。從FD中共分離鑒定出16個化合物，從其他部位中分離出14個化合物，利用HPLC-UV-MS(n)方法結(jié)合文獻(xiàn)鑒定出3個未分到的化合物，即共鑒定出33個化合物。 2.采用GC-MS法對蒼耳子石油醚部位脂肪油成分及蒼耳子超臨界流體萃取的親脂性成分進(jìn)行分析，從中鑒定出38個化合物。其中主要成分為亞油酸，其相對含量在石油醚部位和超

6、臨界流體萃取物中分別占76.33％和86.79％。飽和及不飽和長鏈脂肪酸總含量占親脂性成分的90％以上。 二、藥效學(xué)研究對EXS及FD進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，EXS和FD的MTD分別大于664g生藥/kg和200g生藥/kg，此劑量分別為藥效學(xué)有效劑量(2g生藥/kg)的332倍和100倍，據(jù)此認(rèn)為，EXS和FD口服給藥在有效劑量范圍內(nèi)無毒性。對總提取物、活性部位和單體成分進(jìn)行PCA實(shí)驗(yàn)、大鼠過敏性鼻炎實(shí)驗(yàn)、家兔實(shí)驗(yàn)性鼻竇炎

7、實(shí)驗(yàn)及小鼠扭體實(shí)驗(yàn)和抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，EXS和FD具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用和抗過敏作用，對過敏性鼻炎和鼻竇炎模型動物具有較好的治療作用；FD純化過程中的洗脫組分N84對溶血性鏈球菌具有體外抑菌活性。單體成分中，CE-2、CE-8和CE-15具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，CE-9對PCA反應(yīng)有顯著抑制作用。 三、蒼耳屬的鑒別、種內(nèi)變異及品質(zhì)評價 1.對國產(chǎn)蒼耳的分布情況進(jìn)行了初步的調(diào)查，結(jié)果表明蒼耳為廣布種，資源非常豐富。從全國18個省

8、區(qū)，36個居群采集樣品，并在本校藥用植物園進(jìn)行了25個居群的異地栽培實(shí)驗(yàn)。 2.利用數(shù)量分類學(xué)方法對25個居群異地栽培樣品的20個重要性狀和生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，利用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行聚類，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)對象大體可分為4類，與作者品種鑒定的結(jié)果基本相符。其中廣布種蒼耳X.sibiricum的17個產(chǎn)地的樣品又可以分為4個亞型。另外發(fā)現(xiàn)，深圳產(chǎn)蒼耳子從性狀上看與分屬3個種的其他樣品差別明顯，聚類結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，其品種有待于進(jìn)

9、一步鑒定，具有深入研究的意義。 3.利用GC-MS對3種蒼耳子藥材的脂肪油成分進(jìn)行分析，亞油酸(Linoleicacid)和棕櫚酸(Hexadecanoicacid)為3種蒼耳脂肪油的共有成分，而以亞油酸的含量占絕對優(yōu)勢，分別達(dá)到相對含量的80.24％、70.75％和77.71％。從蒼耳屬主要的3種蒼耳脂肪油中共鑒定出37種成分，其中香橙烯Aromadendrene、水芹烯α-phellandrene、藍(lán)桉醇Globulol、原

10、蒎烷Norphytane、奧索千里光堿Tomentosin等多種成分是從該屬植物中首次鑒定出來。 4.首次對蒼耳子類藥材進(jìn)行HPLC化學(xué)指紋圖譜研究，以HPLC-UV-DAD法建立了上海孫橋產(chǎn)蒼耳子原藥材的指紋圖譜。系統(tǒng)考察了各種因素對制定蒼耳子藥材HPLC指紋圖譜的影響。從全國不同產(chǎn)區(qū)收集了30個蒼耳子樣品，以藥材對照指紋圖譜即共有模式為參照，通過《中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件》計(jì)算，得到各藥材樣品色譜指紋圖譜模擬圖譜及相似度計(jì)

11、算結(jié)果。發(fā)現(xiàn)不同來源蒼耳子之間化學(xué)成分的差異顯著，指紋圖譜聚類分析結(jié)果將30個居群分成三類，即單咖型、雙咖型和深圳型。因此我們提出方案，建立蒼耳子類藥材的兩種對照圖譜，一種為單咖型，一種為雙咖型，分別適用于單咖型蒼耳子藥材和雙咖型蒼耳子藥材。深圳型蒼耳在形態(tài)學(xué)聚類和化學(xué)成分聚類中均單獨(dú)聚為一類，表現(xiàn)了較大的特殊性，值得深入研究。 5.建立了蒼耳子總酚酸含量測定的UV法，測定了30個居群藥材總酚酸的含量。結(jié)果表明，上海孫橋和福建三

12、明產(chǎn)蒼耳子的總酚酸含量最高，可以作為優(yōu)質(zhì)種群。測定了活性部位總酚酸的含量，三批樣品均達(dá)到75％以上。測定同一產(chǎn)地蒼耳根、莖葉和果實(shí)中總酚酸的含量，結(jié)果果實(shí)＞莖葉＞根。 6.建立了同時測定蒼耳子藥材中5個主要酚酸類成分的HPLC-UV含量測定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。5個對照品在2-200ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)＞0.9997；測定了30個居群蒼耳子藥材中5種酚酸類成分的含量，結(jié)果表明，不同來源的樣品5種酚酸類化合物的含

13、量有較大的差異。由于單咖啡酰與雙咖啡酰奎寧酸的藥理活性不盡相同，因此，本研究結(jié)果可以為針對不同藥用價值選擇不同來源的藥材提供參考標(biāo)準(zhǔn)。 7.利用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的熒光定性定量分析功能嘗試進(jìn)行蒼耳子藥材自發(fā)熒光的觀察與熒光強(qiáng)度和化學(xué)成分相關(guān)性的研究。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，綠原酸及其類似物是影響蒼耳子紫色自發(fā)熒光強(qiáng)度的主要物質(zhì)之一，從熒光強(qiáng)度可以反映出藥材所含該類物質(zhì)的相對含量。提示我們，藥材所發(fā)出的紫色熒光的強(qiáng)度可以作為判