血小板骨架蛋白Gelsolin在冠心病血瘀證中的作用及赤芍川芎有效組分的干預效應研究.pdf

1、本課題組前期研究結(jié)果表明冠心病、血瘀證、血小板功能狀態(tài)三者之間存在極其密切的內(nèi)在聯(lián)系，我們采用血小板差異蛋白組學的研究方法，篩查了冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證患者和健康對照人群的血小板差異功能蛋白，建立了冠心病血瘀證血小板差異蛋白表達譜。研究發(fā)現(xiàn)，血小板骨架蛋白凝溶膠蛋白(Gelsolin)是冠心病血瘀證與非血瘀證患者的血小板差異蛋白之一，其含量在冠心病血瘀證患者血小板中明顯增多，提示血小板骨架蛋白的異常表達在冠心病血瘀證發(fā)生發(fā)展中可能

2、起到關(guān)鍵作用。
　　梗死后心肌組織釋放大量肌動蛋白微絲(F-actin)對內(nèi)皮細胞和微血管產(chǎn)生毒害，血漿Gelsolin可切割F-actin解聚成肌動蛋白單體(G-actin)，并通過肝臟內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除體外而阻止這種細胞毒。前期課題組差異蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)血小板Gelsolin與冠心病血瘀證明顯相關(guān)，血小板無轉(zhuǎn)錄本信息，故我們推測血小板Gelsolin含量升高是由于血漿Gelsolin消耗而引起血小板骨架蛋白反應性重組，這種病Nt

3、。生升高進一步加速血小板活化、變形而參與冠心病血瘀證形成。
　　本研究擬通過冠心病血瘀證貧、富血小板血漿Gelsolin含量與血小板活化相關(guān)性對這一假說進行驗證，并借助F-actin誘導血小板活化體外和急性心肌梗死大鼠體內(nèi)血小板活化實驗體系，研究Gelsolin參與血瘀證形成過程及赤芍川芎有效組分配伍對血小板Gelsolin重組的調(diào)控及對血小板聚集、活化的影響。本研究將為活血化瘀中藥抗血小板活化提供一定實驗依據(jù)。
　　本課題

4、研究分為三部分：文獻綜述、臨床研究和實驗研究。
　　1.文獻綜述：本部分分別從凝溶膠蛋白和心血管疾病、活血化瘀方藥和抗血小板治療兩個方面進行綜述。
　　2.臨床研究：包括以下兩個部分。
　　研究一冠心病血瘀證血小板差異蛋白Gelsolin的臨床鑒定
　　目的：分別應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印跡法(WB)，對冠心病血瘀證血小板差異蛋白Gelsolin進行臨床鑒定。
　　方法：冠心病診斷參照19

5、99年及2002年美國心臟病學會(ACC)/美國心臟協(xié)會(AHA)/美國醫(yī)師學會及美國內(nèi)科學會(ACP-ASIM)聯(lián)合協(xié)定關(guān)于《慢性穩(wěn)定性心絞痛診療指南》、《不穩(wěn)定性心絞痛、無ST段抬高心肌梗死診療指南》。同時，參考中國中西醫(yī)結(jié)合學會活血化瘀專業(yè)委員會制定的血瘀證診斷標準。篩選符合冠心病、血瘀證、健康人入選標準的冠心病血瘀證組、冠心病非血瘀證組和健康對照組各30例為研究對象。冠心病血瘀證和非血瘀證患者于冠脈造影前采血，健康對照者于清晨空

6、腹狀態(tài)下抽取靜脈血7 mL，前2mL棄用，梯度離心法分別獲取富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。分別應用酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白免疫印跡法檢測各組人群PRP和PPP的Gelsolin含量。
　　結(jié)果：冠心病血瘀證組、非血瘀證組和健康對照組在年齡、性別、體重指數(shù)且兩疾病組在冠心病類型、冠脈病變支數(shù)、合并疾病和用藥情況方面無顯著性差異，具有可比性。與健康對照組相比，冠心病血瘀證組患者富血小板血漿中的Gelsolin含量顯著性升

7、高(P<0.01)，貧血小板血漿中的Gelsolin含量明顯降低(P<0.05)，冠心病非血瘀證組患者貧血小板血漿中Gelsolin含量亦明顯降低(P<0.05)，富血小板血漿中Gelsolin含量無明顯差異(P>0.05)；與冠心病非血瘀證組相比，冠心病血瘀證患者富血小板血漿中Gelsolin含量明顯升高(P<0.05)，貧血小板血漿中Gelsolin含量無明顯差異(P>0.05)。酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果一致。

8、　　結(jié)論：Gelsolin作為細胞骨架蛋白的重要組成部分，在冠心病血瘀證狀態(tài)下，其在富血小板血漿和貧血小板血漿中的含量分布存在差異性，與前期血小板蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果相一致，可能參與了冠心病血瘀證的形成過程。
　　研究二血小板Geisolin水平與冠心病血瘀證相關(guān)性研究
　　目的：研究血小板Gelsolin水平與冠心病血瘀證的相關(guān)性。
　　方法：納入冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證患者各57例和健康對照組45例為研究對象。冠

9、心病血瘀證和非血瘀證患者于冠脈造影前采血，健康對照者于清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血12mL，前2mL棄用，梯度離心法分別獲取富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。采用ELISA法分別測定PRP中Gelsolin含量及PPP中Gelsolin、肌動蛋白微絲(F-acdn)及維生素D結(jié)合蛋白(DBP)的含量；采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測血小板胞漿Ca2+濃度及反映血小板活化程度的CD62p的表達。
　　結(jié)果：冠心病血瘀證組、非血

10、瘀證組和健康對照組在年齡、性別、體重指數(shù)且兩疾病組在冠心病類型、冠脈病變支數(shù)、合并疾病和用藥情況方面無顯著性差異，具有可比性。與健康對照組相比，冠心病血瘀證患者PRP中Gelsolin含量顯著升高(P<0.01)，冠心病血瘀證及非血瘀證患者PPP中Gelsolin含量明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)-actin及DBP含量明顯升高(P<0.01)，血小板CD62p表達及胞漿鈣離子濃度顯著升高(P<0.01)。與冠心病非血瘀證組相比，冠心病血

11、瘀證組患者PRP中Gelsolin含量及胞漿鈣離子濃度明顯升高(P<0.01)，血小板CD62p表達明顯增高(P<0.05)，PPP中Gelsolin、F-actin及DBP含量無明顯差異(P>0.05)。對冠心病血瘀證組患者血小板Gelsolin含量與血小板活化標志物CD62p的表達進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示冠心病血瘀證組患者血小板Gelsolin含量與血小板活化標志物CD62p高度正相關(guān)(P<0.01)。
　　結(jié)論：血小板Gel

12、solin水平與冠心病血瘀證血小板活化水平高度相關(guān)，在冠心病血瘀證血小板活化過程中，細胞骨架蛋白含量也出現(xiàn)了不同程度的變化，集中體現(xiàn)在血小板Gelsolin和其靶蛋白F-actin的異常變化上，推測血漿Gelsolin含量降低與其因切割、清除F-actin而大量消耗有關(guān)，這種消耗引起血小板上的Gelsolin病理性重組，同時引起血小板鈣離子內(nèi)流增加，導致血小板變形能力增強而參與冠心病血瘀證的形成，因此血小板Gelsolin可能是冠心病血

13、瘀證的特異性分子靶標之一。
　　3.實驗研究：包括以下兩個部分。
　　研究一赤芍川芎有效組分對F-actin刺激的血小板活化及血小板Geisolin水平的體外干預效應研究
　　目的：研究F-actin體外刺激對血小板活化及血小板Gelsolin含量的影響，同時觀察赤芍、川芎有效組分的體外干預效應
　　方法：以人水洗血小板作為研究對象，以不同濃度的F-actin作為體外血小板活化誘導劑，同時以花生四烯酸(AA)、二

14、磷酸腺苷(ADP)以及凝血酶(Thrombin)作為陽性對照誘導劑。同時以赤芍川芎有效組分芍藥苷和川芎嗪聯(lián)合作為干預藥物，以阿司匹林作為陽性對照藥物。采用流式細胞術(shù)檢測血小板活化標志物CD62p的表達，使用血小板聚集儀測定最大血小板聚集率，采用ELISA法測定血小板Gelsolin的含量。
　　結(jié)果：①低(2.5μmol/L)、中(5μmol/L)、高(10μmol/L)不同濃度的F-actin以及AA、ADP和凝血酶(Throm

15、bin)均可引起血小板聚集率和血小板活化水平明顯升高(P<0.05及P<0.01)，且F-actin隨濃度的不斷增加其致血小板聚集和活化程度不斷增高，呈現(xiàn)濃度依賴性。F-actin最大濃度(10μmol/L)時刺激的最大血小板聚集率與血小板活化水平與同濃度的AA、ADP及Thrombin刺激組無明顯差異(P>0.05)。
　　②低濃度(2.5μmol/L)的F-actin、ADP及Thrombin的刺激對血小板gelsolin含量

16、無明顯影響(P>0.05)，中(5μmol/L)、高(10μmol/L)濃度的F-actin以及AA均可刺激血小板Gelsolin含量明顯增高(P<0.05)。F-actin最大濃度(10μmol/L)時刺激的血小板gelsolin含量與同濃度的AA無明顯差異(P>0.05)。
　?、鄞ㄜ亨汉蜕炙庈章?lián)合體外可以明顯抑制由同濃度的F-actin和AA誘導的血小板聚集和活化反應(P<0.05)，與阿司匹林相比無明顯差異(P>0.05)

17、。水洗血小板預先用川芎嗪和芍藥苷聯(lián)合孵育后，再用F-actin或AA誘導，可明顯降低血小板Gelsolin含量(P<0.05)，但預先用阿司匹林體外孵育無此效應(P>0.05)。
　　結(jié)論：F-actin體外能夠激活血小板導致其聚集、活化，且高濃度能夠刺激血小板大量分泌Gelsolin，其效應與AA相似。赤芍、川芎有效組分芍藥苷、川芎嗪體外聯(lián)合應用對聚集、活化后的血小板具有明顯抑制作用，同時能夠明顯降低活化后血小板Gelsolin

18、的含量，而阿司匹林體外干預無此效應。
　　研究二赤芍川芎有效組分對急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的干預效應研究
　　目的：研究赤芍、川芎有效組分對急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的體內(nèi)干預機制
　　方法：通過在體結(jié)扎前降支方法建立急性心肌梗死大鼠模型，以赤芍川芎有效組分配伍藥物芎芍膠囊(XSC)作為干預藥物，同時以阿司匹林及鈣離子拮抗劑維拉帕米作為陽性對照藥物，觀察

19、芎芍膠囊對模型大鼠血小板活化及血小板Gelsolin含量及其相關(guān)指標的干預效應。血漿梯度離心法獲得大鼠PRP和PPP，使用ELISA法測定Gelsolin、F-actin、DBP、P-選擇素以及CK-MB、cTnI的含量，使用流式細胞術(shù)測定大鼠血小板鈣離子濃度，使用WB法測定梗死區(qū)心肌組織Gelsolin的蛋白表達。
　　結(jié)果：①模型大鼠結(jié)扎前降支3小時后心肌損傷標志物血清CK-MB、cTnI含量均顯著增高(P<0.05)，同時血

20、小板活化特異性指標血漿P-選擇素含量亦較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；XSC高劑量組能夠明顯降低模型組大鼠血清CK-MB、cTnI水平(P<0.05)，同時能夠降低血漿P-選擇素、COX-1及TXB2水平(P<0.05)，其效應與阿司匹林組無明顯差異；
　?、谀Ｐ徒M大鼠血漿F-actin含量顯著增高(P<0.05)而血漿Gelsolin、DBP含量明顯降低(P<0.05)，同時血小板Gelsolin含量明顯增高(P<0.05)

21、；XSC高劑量能夠明顯降低模型組大鼠血小板Gelsolin以及血漿F-actin水平(P<0.05)，同時能夠使血漿Gelsoin以及DBP含量顯著升高(P<0.05)；模型組及XSC高劑量組大鼠血小板Gelsolin與血小板活化標志物P-選擇素水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。
　?、勰Ｐ徒M大鼠血小板鈣離子熒光強度明顯增強(P<0.05)，XSC高劑量能夠明顯抑制模型大鼠血小板鈣離子內(nèi)流(P<0.05)，其效應與維拉帕米無明顯差異

22、(P>0.05)。
　　④模型大鼠梗死區(qū)心肌組織Gelsolin蛋白表達明顯增強，而XSC可以明顯抑制其表達，但鈣拮抗劑維拉帕米無此效應。
　　結(jié)論：赤芍川芎有效組分能明顯降低血小板Gelsolin水平，增強血漿肌動蛋白清除系統(tǒng)活性，抑制血小板活化，同時具有一定的鈣拮抗效應，且在抑制COX-1活性、降低TXB2水平方面與阿司匹林相似。同時，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，赤芍川芎有效組分抑制血小板活化程度與降低血小板Gelsolin含量有