新型PCL-PEG-Chitosan和PEI600-CyD納米非病毒基因輸送體系的體外研究.pdf

1、目的：
　　 優(yōu)化新型納米非病毒載體PCL-PEG-Chitosan和PEI600-CyD在體外與質粒的復合條件。評價這兩種非病毒載體對于骨關節(jié)相關細胞的細胞毒性。研究其與質粒組成的復合物對于骨關節(jié)相關細胞的基因轉染效率，并對此過程中質粒的運動情況和分布情況進行探索。為這些納米非病毒基因輸送體系進一步用于骨關節(jié)疾病的基因治療給予參考。
　　 方法：
　　 1．在體外利用凝膠電泳方法確定非病毒載體與質粒復合的最小氮

2、磷比（N/P）。
　　 2．利用動態(tài)光散射粒徑測量儀確定復合物在不同氮磷比、不同緩沖溶液體系下粒徑的變化情況。
　　 3．分別從健康雄性SD 大鼠的骨髓中分離得到骨髓間充質干細胞（BMSCs），膝關節(jié)中分離得到滑膜細胞和軟骨細胞。利用MTT實驗，來確定非病毒載體PEI600-CyD 分別對于這三種細胞的細胞毒性。
　　 4．將帶有綠色熒光蛋白基因的質粒（pEGFP）同PCL-PEG-Chitosan和PEI600

3、-CyD 進行復合后對細胞進行轉染實驗，然后利用流式細胞分析技術定量統(tǒng)計轉染效率。
　　 5．分別利用量子點和熒光素兩種不同的標記方法對質粒進行標記，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察復合物轉染細胞后，質粒在細胞中的分布情況。
　　 結果：
　　 1．凝膠電泳結果顯示非病毒載體PCL-PEG-Chitosan 與pEGFP 復合的最小氮磷比為4：1，同時PCL-Chitosan 與pEGFP 復合的最小氮磷比也為4：1，

4、而Chitosan 與pEGFP 復合的最小氮磷比則為1：1。
　　 2．動態(tài)光散射實驗結果顯示非病毒載體PCL-PEG-Chitosan 與pEGFP復合而成的復合物的粒徑隨著氮磷比的增大而減小，并且這些復合物在NaAc 緩沖體系和DMEM 緩沖體系中，粒徑基本一致，相對穩(wěn)定。
　　 3． MTT 實驗顯示，非病毒載體PEI600-CyD 對于原代軟骨細胞，原代滑膜細胞，原代骨髓間充質干細胞的細胞毒性要明顯小于非病毒載

5、體PEI-25kDa。
　　 4．利用熒光顯微鏡觀察發(fā)現，PCL-PEG-Chitosan 同pEGFP 在氮磷比為32 時組成的復合物對于293t 細胞的轉染效率明顯不及Lipo2000。
　　 5．利用流式細胞儀檢測發(fā)現，PEI600-CyD 的對于原代骨髓間充質干細胞和原代軟骨細胞的轉染效率要明顯高于Lipo2000，而Lipo2000對于原代滑膜細胞的轉染效率要明顯高于PEI600-CyD。
　　 6．利

6、用量子點標記技術和熒光素標記技術分別標記pEGFP 后發(fā)現，利用PEI600-CyD 轉染骨髓間充質干細胞后，質粒在細胞核內分布的數量要高于Lipo2000。
　　 結論：
　　 1．聚己內酯（polycaprolactone，PCL）修飾會使得殼聚糖（Chitosan）對于pEGFP的復合能力有所減弱，提高最低復合氮磷比。而聚乙二醇（poly(ethylene glycol)，PEG）修飾對于最低復合氮磷比則沒有影響。