IgA腎病患者外周血單個核細胞活化與凋亡及雷公藤甲素干預研究.pdf

1、IgA腎病IgA nephropathy，IgAN)是一類以反復發(fā)作性肉眼血尿或鏡下血尿，腎小球系膜區(qū)IgA沉積為特征的原發(fā)性腎小球疾病。免疫細胞、細胞因子是IgAN發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和一氧化氮(nitricoxide,NO)是免疫應答及炎癥反應細胞因子網(wǎng)絡中的重要成分，被認為是各種腎小球腎炎疾病中導致或加

2、重腎臟損傷的重要物質。大量實驗證明淋巴細胞凋亡與自身免疫性疾病發(fā)病相關，研究表明轉染人Bc1-2導致B細胞凋亡缺陷的(NZW×B6)F1-hbc1-2Tg小鼠可發(fā)展為高IgA免疫球蛋白血癥和IgAN。因此IgANPBMC中炎癥介質及凋亡情況在發(fā)病機制中所起的作用值得進一步研究。
　　 雷公藤多甙(TripterygiumWilfordiiHookf)因其獨特的抗炎及免疫抑制效應已廣泛應用于治療以系膜增生為主的IgAN，其療效已被

3、大量的臨床及實驗研究證實。它不僅可以使腎臟病變減輕，而且可使血尿減輕以至消失，但其治療IgAN的具體機制國內外尚缺乏相關研究，其對IgAN患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的作用尚未見報道。雷公藤甲素(triptolide,TP)是從雷公藤中分離得到的二萜內酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。本實驗研究IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6、NO表達與凋亡情況，以及

4、TP對上述指標的影響。
　　 第一章IgA腎病患者外周血單個核細胞分泌TNF-α、IL-6、NO及其相關性研究
　　 目的：研究IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6、NO表達情況，探討其與發(fā)病機制的關系及免疫紊亂程度與臨床資料之間的關系。
　　 方法：臨床和病理確診的IgAN患者29例，以及健康體檢者16名，分離IgAN患者和正常對照組PBMC，應用RT-PCR檢測PBMC中TNF-α、IL-6mRNA的表

5、達水平，同時分離血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法測定其中TNF-α、IL-6的濃度，用硝酸還原酶法(Griess法）檢測其NO的含量。
　　 結果：
　　 1.IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6mRNA表達較正常人顯著增加(P＜0.05；P＜0.01)；
　　 2.IgAN患者血漿TNF-α、IL-6、NO濃度明顯高于正常對照組(P＜0.01)，且三者含量均呈正相關。
　　 3.IgANL

6、ee氏分級Ⅲ、Ⅳ級患者血漿TNF-α、IL-6、NO含量高于Lee氏Ⅰ、Ⅱ級，腎功能受損(Ccr＜60ml/mim)患者血漿TNF-α、IL-6含量高于非腎功能受損患者(Ccr＞60ml/mim)，NO含量低于非腎功能受損患者。
　　 4.相關性分析發(fā)現(xiàn)，24h尿蛋白排泄量與血漿TNF-α濃度正相關(r＝0.27,P＜0.05)，腎臟病理損害程度與血漿TNF-α、IL-6、NO濃度正相關(r＝0.56,P＜0.01;r＝0.38

7、,P＜0.05;r＝0.31,P＜0.05)，血尿、血IgA和C3水平與血漿TNF-α、IL-6、NO濃度均無相關性。
　　 結論：IgAN患者體內存在促炎性介質TNF-α、IL-6、NO生成增高，并在其疾病進展中起到重要作用。
　　 第二章：IgA腎病患者外周血單個核細胞凋亡情況及其相關蛋白表達
　　 目的：探討PBMC凋亡及其調控蛋白在IgAN發(fā)病機制中作用。
　　 方法：應用AnnexinV-FIT

8、C凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀檢測IgAN患者及正常人PBMC凋亡率，并采用WestenBlot方法檢測IgAN患者及正常人PBMC中凋亡調控蛋白Bc1-2、Bax表達情況。
　　 結果：
　　 1.IgAN患者PBMC早期凋亡率較正常對照組增多(P＜0.01)，24小時尿蛋白量＞1gIgAN患者組PBMC早期凋亡率高于24小時尿蛋白量＜1g組，IgAN患者PBMC早期凋亡率與其血漿TNF-α、IL-6含量明顯相關(TNF

9、-α/凋亡率：t＝2.79，P＜0.05；IL-6/凋亡率：t＝2.77，P＜0.05)，與血尿、血IgA、血C3水平以及腎臟病理損害程度無相關性；
　　 2.IgAN患者組Bc1-2蛋白的平均相對表達水平高于正常對照組，但無統(tǒng)計學差異(P＝0.09)；
　　 3.IgAN患者與正常人對照組PBMC中Bax蛋白平均相對表達水平之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：IgAN患者PBMC早期凋亡率增高可

10、能繼發(fā)于體內免疫紊亂，并參與IgAN發(fā)病。凋亡抑制蛋白Bc1-2高表達可能導致自身反應性T、B淋巴細胞壽命延長，產(chǎn)生過多的IgA抗體，從而導致腎小球系膜區(qū)IgA沉積增多和IgAN的發(fā)生。
　　 第三章：雷公藤甲素對IgA腎病患者外周血單個核細胞抑制作用研究
　　 目的：觀察雷公藤甲素(triptolide，TP)對體外培養(yǎng)IgAN患者PBMC免疫抑制及凋亡誘導作用。
　　 方法：體外分離、培養(yǎng)IgAN患者PBMC

11、，采用四唑鹽比色(MTT)間接法觀察TP在不同時間段和不同劑量下殺傷活性的變化。培養(yǎng)PBMC，分為陰性對照組、PHA(10μg/ml)模型組和PHA(10μg/ml)＋TP(12.5ng/ml、25ng/ml)處理組，采用定量Realtime-PCR檢測TNF-α、IL-6在基因水平表達的變化，用硝酸還原酶法（Griess法）檢測細胞培養(yǎng)上清NO的含量變化，酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測上清液中TNF-α、IL-6的分泌情況。應用流

12、式細胞儀，AnnexinV-FITC雙染色分析TP誘導細胞凋亡，RT-PCR、WesternBlot方法檢測PBMC中Bc1-2、Bax、Caspase9、Caspase3基因和蛋白水平的表達變化。
　　 結果：
　　 1.MTT結果顯示，在0、5、10、20、40、80ng/ml及24h、48h、72h之內TP對IgAN患者PBMC具有生長抑制作用，呈濃度和時間依賴性；
　　 2.12.5ng/ml和25ng/

13、ml濃度TP對PBMC作用24h后能明顯抑制TNF-α、IL-6mRNA表達(P＜0.01)，且基因表達水平與TP濃度之間存在負相關(TNF-α:r＝－0.98,P＜0.01;IL-6:r＝－0.93,P＜0.01)，TP作用24h后，IgAN患者PBMC培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、NO含量明顯減低(P＜0.01)，蛋白分泌量與TP濃度之間存在負相關(TNF-α:r＝-0.95,P＜0.01;IL-6:r＝－0.98,P＜0.01

14、;NO:r＝－0.91,P＜0.01)；
　　 3.PHA＋TP(12.5ng/ml、25ng/ml)處理組細胞凋亡率較PHA模型組明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，細胞凋亡率與藥物作用濃度正相關(r＝0.89,P＜0.01)；RT-PCR、WesternBlot方法檢測表明，隨處理組所加TP濃度增大，PBMC內細胞內源性Bc1-2表達逐漸降低(P＜0.05)，Bax、caspase3、caspase9表達逐漸增加(P＜0

15、.05)，并且WesternBlot觀察到Caspase9、Caspase3激活帶隨TP濃度的增加明顯上調。
　　 結論：TP能有效抑制IgAN患者PBMCTNF-α、IL-6、NO的表達和分泌；TP可以誘導IgAN患者PBMC凋亡，此作用可能通過線粒體途徑以及改變Bc1-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的基因和蛋白表達有關。
　　 全文總結：
　　 1.證實IgAN患者體內存在炎性介質TNF-α、IL-6、NO生成

16、增高，體內淋巴細胞處于高活性狀態(tài)，并在其疾病進展中起到重要作用。
　　 2.證實IgAN患者PBMC早期凋亡率增高，結合前期研究可能繼發(fā)于體內免疫紊亂，并參與IgAN發(fā)病過程。凋亡抑制基因蛋白Bc1-2高表達，可能導致自身反應性T、B淋巴細胞壽命延長，產(chǎn)生過多的IgA抗體，從而導致腎小球系膜區(qū)IgA沉積增多和IgAN的發(fā)生。
　　 3.證實TP能有效抑制IgAN患者PBMCTNF-α、IL-6、NO的生成和分泌；TP可誘