線粒體動力學異常在異氟烷致發(fā)育期大鼠神經元毒性中作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　據2006年報道,僅美國每年約有600萬嬰幼兒在全身麻醉(全麻)下接受手術,其中嬰兒約150萬;盡管中國目前尚無相關數(shù)據,但基于國內的人口規(guī)模,每年接受全麻手術的嬰幼兒應比美國多。由于人類神經系統(tǒng)發(fā)育始于妊娠4-5w,而止于出生后若干年后;一般認為人類大腦發(fā)育高峰期在妊娠后期至出生后6m。因此全麻是否對患兒智力發(fā)育及其長期認知功能產生不良影響是近年來備受關注的熱點問題。
　　已有臨床研究表明,嬰幼兒時期,特別

2、是兩歲以內的嬰兒接受全身麻醉會導致較長時期的行為改變,提示全麻藥可能損害嬰幼兒中樞神經系統(tǒng)。近年來基礎研究發(fā)現(xiàn),在神經系統(tǒng)發(fā)育關鍵期(嚙齒類動物為出生前兩天到出生后1~2w),全麻藥(異氟烷、七氟烷、地氟烷、氯胺酮及異丙酚)影響動物發(fā)育期神經系統(tǒng)突觸可塑性,并導致發(fā)育期神經元凋亡及其它退行性神經病變,最后影響成年期動物的學習記憶功能。
　　吸入麻醉藥在臨床麻醉中應用非常廣泛。新近研究表明,吸入麻醉藥異氟烷致發(fā)育期神經元內鈣穩(wěn)態(tài)失衡

3、,最終觸發(fā)線粒體途徑凋亡。但是吸入麻醉藥影響線粒體結構和功能的確切機制尚不清楚。如果小兒全麻不可避免,那么闡明吸入麻醉藥導致線粒體結構和功能異常的準確機制,并探索有效的防治手段,是亟待解決的難題之一。
　　線粒體是一個不斷進行分裂、融合等動態(tài)變化的細胞器,這種動態(tài)變化稱為線粒體動力學。線粒體分裂/融合主要受一下兩組蛋白的調控:(1)調節(jié)線粒體分裂的drp-1(dynamin-relatedprotein)、mff(mitochon

4、drialfissionfactor)、FIS1;(2)調節(jié)線粒體融合的mfn(mitofusion1)1、mfn2、OPA1(opticatrophy1)。生理狀況下,線粒體分裂/融合既決定線粒體形狀和大小,也調節(jié)線粒體的分布和功能,對維持細胞生理功能發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn),神經元內線粒體分裂/融合異常影響神經突生長、突觸形成、長時程增強,甚至神經元凋亡等。
　　調節(jié)線粒體分裂、融合的蛋白參與了很多神經退行性疾病過程中神經元

5、凋亡和突觸聯(lián)系障礙等病理變化。在凋亡早期,哺乳動物細胞中drp-1活性增加,促進線粒體碎片化和分裂,增加線粒體膜的通透性,促使細胞色素C(cytochromeC,cyto-C)釋放,最終觸發(fā)線粒體途徑凋亡。在阿爾茨海默病和亨廷頓舞蹈癥等研究中發(fā)現(xiàn),β淀粉樣蛋白(Aβ)、亨廷頓蛋白(huntingtin,HTT)及帕金蛋白(Parkin)都可促使神經元內drp-1表達上調且與drp-1相互作用,激活drp-1,促進線粒體過度分裂甚至碎片化

6、,進而導致線粒體動力學異常,甚至神經元凋亡并損害突觸聯(lián)系的建立,最終導致患者長期認知功能障礙。由此可見,線粒體異常分裂是凋亡的早期表現(xiàn);神經元線粒體分裂、融合失衡是退行性神經病變的病理生理基礎。
　　神經元胞漿Ca2+可通過多種信號通路調控線粒體動力學蛋白活性,繼而調節(jié)線粒體動力學,影響神經元存活及其他功能。在傷害性刺激下,神經元胞漿Ca2+濃度([Ca2+]c)持續(xù)升高,繼而激活鈣調神經磷酸酶(calcineurin,CaN),

7、引起drp-1第637絲氨酸去磷酸化,導致drp-1活性增強并向線粒體移位,促進線粒體分裂,進而引起線粒體片段化甚至神經元凋亡,最終干擾突觸聯(lián)系及神經環(huán)路形成。本項目組的前期研究證實,臨床相關濃度的異氟烷可致神經元[Ca2+]c升高。但是,異氟烷是否通過這條信號通路,引起線粒體分裂/融合失衡并最終導致發(fā)育期神經元毒性有待于進一步研究。
　　因此本研究擬從離體細胞和在體動物水平,根據異氟烷作用后,線粒體形態(tài)及線粒體動力學調節(jié)蛋白表達

8、的變化,選擇對線粒動力學起重要作用的調節(jié)蛋白,闡述線粒體動力學失調在異氟烷抑制發(fā)育期神經元毒性作用中的機制。
　　研究方法與結果：
　　1.異氟烷對發(fā)育期神經元線粒體形態(tài)學和膜電位的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d(DIV5)海馬神經元隨機分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組)。C組在5％CO2-8%O2-87%N2三氣培養(yǎng)箱中處理6h;I組以5%CO2-8%O2-87%N2作為載體氣,1.5%異氟烷處理6h,采用電鏡觀

9、察線粒體形態(tài)學的變化。DIV3海馬神經元,轉染CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0,異氟烷處理后在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)學改變
　　結果:與C組比較,I組線粒體直接明顯減小(P<0.05)。在轉染了CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0的神經元中,與C組比較,I組神經元變圓變小。
　　2.異氟烷對發(fā)育期神經元線粒體膜電位的影響
　　方法:體外

10、培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。1.5%異氟烷處理6h。選用JC-1染色后在激光共聚焦顯微鏡和細胞流式儀下觀察線粒體膜電位變化。
　　結果:與C組標膠,I組神經元線粒體膜電位明顯去極化(P<0.05)。
　　3.異氟烷對發(fā)育期神經元內線粒體分裂/融合調節(jié)蛋白mRNA和蛋白表達水平的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。

11、異氟烷結束后,提取總RNA和總蛋白,分別進行實時定量PCR和WesternBlot(WB)方法檢測線粒體動力學調節(jié)蛋白的mRNA和蛋白水平的表達變化
　　結果:與C組相比,I組線粒體動力學調節(jié)蛋白在mRNA和蛋白水平的表達差異均無顯著性(P>0.05)。
　　4.異氟烷對發(fā)育期神經元p-drp-1表達的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。異氟烷麻醉結束后提取總

12、蛋白,采用WB方法檢測drp-1第637絲氨酸磷酸化的表達(p-drp-1(ser637))。選用免疫熒光雙標檢測p-drp-1(ser637)的表達變化。
　　結果:與C組比較,I組p-drp-1(ser637)表達明顯下調(P<0.05)。
　　5.抑制drp-1對異氟烷誘發(fā)發(fā)育期神經元線粒體膜電位去極化的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為對照組(C組)、異氟烷組(I組)、mdivi-1預給藥后異氟

13、烷處理組(M+I組)及mdivi-1處理組(M組)。M+I組和M組在異氟烷處理2h前在無血清培養(yǎng)基中加入5μMmdivi-1,而后C組和M組載體氣處理6h,I組和M+I組1.5%異氟烷處理6h。異氟烷處理結束后,進行JC-1染色,在激光共聚焦顯微鏡和細胞流式儀下檢測線粒體膜電位。
　　結果:與C組比較,M+I組和M組線粒體膜電位沒有明顯變化(P>0.05),I組線粒體膜電位明顯去極化(P<0.05);與I組比較,M+I組和M組線粒

14、體膜電位水平較高(P<0.05)。
　　6.Mdivi-1對異氟烷誘發(fā)發(fā)育期神經元線粒體形態(tài)學的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為C組、I組、M+I組、M組,處理同上。異氟烷處理結束后,采用電鏡觀察線粒體形態(tài)學的變化,采像后的圖片在Imaris下進行處理統(tǒng)計。采用CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0在海馬神經元體外培養(yǎng)3d時轉染,在異氟烷處理結束后,固定、封片后在激光共聚焦顯

15、微鏡下觀察線粒體形態(tài)學改變。
　　結果:與C組比較,M組及M+I組線粒體直徑差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);I組線粒體直徑減小(P<0.05);線粒體密度增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與I組比較,M+I組線粒體直徑增大(P<0.05);線粒體密度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　7.Mdivi-1對異氟烷誘發(fā)發(fā)育期神經元存活率及凋亡相關蛋白表達的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為C組

16、、I組、M+I組、M組,處理同上。采用WB檢測細胞色素C(cytochromeC,cyto-C)的表達;采用免疫熒光雙標檢測activecaspase3染色陽性細胞數(shù)目。
　　結果:與C組比較,M組所檢測指標差異無顯著性(P>0.05);I組AC3(activecaspase3)和cyto-C蛋白表達上調,AC3陽性神經元數(shù)目增多(P<0.05)。與I組比較,M+I組cyto-C蛋白表達降低,AC3陽性神經元數(shù)目減少(P<0.05

17、)。
　　8.異氟烷對鈣神經磷酸酶的表達和活性的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。采用試劑盒檢測CaN活性;提取總蛋白,用WB方法檢測CN表達。
　　結果:與C組比較,CaN表達明顯上調,活性明顯增強(P<0.05)。
　　9.CaN抑制劑FK506對異氟烷誘導的p-drp-1表達和線粒體形態(tài)學改變的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機

18、分為對照組(C組)、異氟烷組(I組)、FK506預給藥后異氟烷處理組(F+I組)及FK506處理組(F組)。F+I組和F組在異氟烷處理2h前在無血清培養(yǎng)基中加入5μMFK506,而后C組合F組載體氣處理6h,I組和F+I組1.5%異氟烷處理6h。異氟烷處理結束后,WB檢測p-drp-1的表達。采用CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0在海馬神經元體外培養(yǎng)3d時轉染,在異氟烷處理結束后,固定、封片后在激光共

19、聚焦顯微鏡下觀察線粒體形態(tài)學改變,采像后的圖片在Imaris下進行處理統(tǒng)計。
　　結果:與C組比較,F組及F+I組所檢測指標差異無顯著性(P>0.05);I組p-drp-1表達降低,線粒體直徑減小(P<0.05)。與I組比較,F+I組p-drp-1表達升高,線粒體直徑增加(P<0.05)。
　　10.FK506對異氟烷誘導的發(fā)育期神經元凋亡的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經元隨機分為C組、I組、F+I組、F組,

20、處理同上。采用WB檢測cyto-C的表達;采用免疫熒光雙標檢測AC3的表達。
　　結果:與C組相比,F組及F+I組所檢測指標差異無顯著性(P>0.05);I組cyto-C蛋白表達上調,AC3陽性神經元數(shù)目增多(P<0.05)。與I組相比,F+I組cyto-C蛋白表達降低,AC3陽性神經元數(shù)目減少(P<0.05)。
　　11.異氟烷對新生5d(postnatal5day,PND5)大鼠海馬線粒體形態(tài)學的影響
　　方法:P

21、ND5大鼠,隨進分為C組合I組。C組吸入30%O2-70%N26h,I組以30%O2-70%N2作為載氣1.5%異氟烷處理6h,然后電鏡灌注液灌注后,取標本放入2.5%戊二醛固定后,進行電鏡檢測。
　　結果:與C組相比,I組海馬線粒體直徑減小(P<0.05),甚至有部分線粒體破裂。
　　12.異氟烷對PND5大鼠海馬線粒體動力學調節(jié)蛋白及p-drp-1表達的影響
　　方法:PND大鼠1.5%異氟烷處理6h后,取海馬組織

22、,提取總蛋白和總RNA,采用WB和實時定量PCR檢測線粒體動力學調節(jié)蛋白及p-drp-1的表達
　　結果:與C組相比,I組海馬線粒體動力學調節(jié)蛋白表達在mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但是p-drp-1表達明顯降低(P<0.05)。
　　13.Mdivi-1對異氟烷誘導的PND5大鼠海馬神經元凋亡的影響
　　方法:PND大鼠隨機分為四組:C組、I組、M+I組及M組。C組和I組處理同前;M+I組在麻醉

23、2h前腹腔注射5μg/kgmdivi-1,然后1.5%異氟烷處理6h;M組腹腔注射5μg/kgmdivi-1然后吸入30%O2-70%N2。麻醉結束后,盡取海馬組織,提取總蛋白和總RNA,采用WB和實時定量PCR檢測cyto-C的表達。1.5%異氟烷處理6h后,4%多聚甲醛固定,取大腦切片,采用免疫熒光雙標檢測AC3陽性神經元數(shù)目。
　　結果:與C組相比,M+I組和M組所檢測指標無明顯差異(P>0.05);I組cyto-C蛋白表達

24、上調,AC3陽性神經元數(shù)目增多(P<0.05)。與I組相比,M+I組cyto-C表達降低,AC3陽性神經元數(shù)目減少(P<0.05)。
　　14.Mdivi-1對異氟烷誘導的PND5大鼠長期認知障礙的影響
　　方法:PND大鼠1.5%異氟烷處理6h后,待其完全清醒,送回原籠飼養(yǎng)至60d,進行水迷宮檢實驗檢測其空間學習記憶功能。實驗完成后,麻醉電鏡固定液灌注固定后,取海馬組織進行電鏡檢測線粒體形態(tài)的變化。
　　結果:與C組

25、比較,I組第3~5天時逃避潛伏期延長,探索時間縮短(P<0.05),M+I組和M組逃避潛伏期和探索時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與I組比較,M+I組第3~5d時逃避潛伏期縮短,探索時間延長(P<0.05)。電鏡檢測發(fā)現(xiàn),與C組比較,I組線粒體直徑減少(P<0.05),M+I組和M組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與I相比,M+I組線粒體直徑增加(P<0.05)。
　　15.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS20統(tǒng)計軟件對

26、數(shù)據進行分析,計量資料表示為均數(shù)±標準差(xˉ±s),組間比較采用單因素方差分析,組內比較采用獨立樣本t檢驗;Morris水迷宮大鼠訓練期間數(shù)據采用連續(xù)測量的方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　研究總結：
　　一、主要研究結果
　　1.通過體外原代海馬神經元培養(yǎng)以及在體動物實驗證明臨床相關濃度的異氟烷導致發(fā)育神經元線粒體動力學失衡。
　　2.體外及體內實驗證實,異氟烷激活發(fā)育期神經元CaN,導致drp-1

27、第637位絲氨酸去磷酸化,繼而促使drp-1活性增加并向線粒體移位,導致線粒體過度分裂甚至碎片化,從而觸發(fā)線粒體途徑凋亡。
　　3.體外及體內實驗證實,drp-1抑制劑mdivi-1可減輕異氟烷發(fā)育期神經元凋亡,改善異氟烷所致長期認知功能障礙。
　　二、研究結論
　　異氟烷引起胞漿Ca2+濃度升高,激活CaN,促進drp-1(ser637)去磷酸化,引起drp-1活性增強并向線粒體移位,從而導致線粒體過度分裂甚至碎片化