異氟烷誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)毒性及米諾環(huán)素的保護(hù)作用.pdf

1、背景：異氟烷是目前臨床麻醉中常用的吸入麻醉藥之一，自1982年問世以來已經(jīng)在臨床使用了將近20年時(shí)間。異氟烷適用于包括嬰幼兒在內(nèi)的各年齡段的手術(shù)患者，應(yīng)用范圍廣泛。但是，自1999年首先發(fā)現(xiàn)NMDA 受體阻斷劑能引起發(fā)育期大鼠發(fā)生神經(jīng)元廣泛凋亡以來，有關(guān)異氟烷是否具有發(fā)育期神經(jīng)毒性的問題迅速引起麻醉工作者、神經(jīng)學(xué)家和患者的廣泛關(guān)注。
　　 目前已有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期臨床相關(guān)濃度和時(shí)間的異氟烷麻醉能誘導(dǎo)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括大腦皮層、

2、海馬、丘腦以及脊髓等部位的神經(jīng)元凋亡增加；能影響發(fā)育期神經(jīng)元的神經(jīng)突的生長速度和突起的數(shù)量；并且發(fā)育期的異氟烷麻醉能引起一定時(shí)間后大鼠的行為學(xué)改變。然而，目前研究中仍有許多爭(zhēng)議的地方，特別是異氟烷引起神經(jīng)毒性的機(jī)制和發(fā)育期異氟烷麻醉后是否能遺留長期的結(jié)構(gòu)和行為學(xué)改變及機(jī)制等方面。此外，目前尚缺乏能針對(duì)異氟烷誘導(dǎo)的發(fā)育期神經(jīng)毒性機(jī)制的，能有效預(yù)防或消除此種毒性作用的藥物。
　　 本研究擬首先通過觀察異氟烷麻醉對(duì)發(fā)育期大鼠皮層和海馬

3、神經(jīng)元凋亡、遠(yuǎn)期神經(jīng)元密度和學(xué)習(xí)記憶能力、皮層和海馬前炎癥因子mRNA表達(dá)和相關(guān)信號(hào)通路的影響，明確臨床相關(guān)濃度異氟烷對(duì)發(fā)育期（出生后7天，P7）大鼠的神經(jīng)毒性作用及可能機(jī)制，并為下一步的干預(yù)研究提供可靠的基礎(chǔ)。進(jìn)而通過離體和在體研究觀察米諾環(huán)素對(duì)異氟烷誘導(dǎo)的發(fā)育期神經(jīng)毒性的保護(hù)作用，為有效減輕或消除異氟烷的發(fā)育期神經(jīng)毒性提供藥物選擇。這些研究預(yù)期將為臨床上更加科學(xué)、更加安全使用異氟烷提供理論依據(jù)。
　　 目的：
　　

4、1、明確異氟烷對(duì)發(fā)育期大鼠皮層和海馬神經(jīng)元凋亡和遠(yuǎn)期神經(jīng)元密度的影響；
　　 2、研究異氟烷對(duì)發(fā)育期大鼠大腦前炎癥因子mRNA表達(dá)的影響，探討可能機(jī)制；
　　 3、明確發(fā)育期異氟烷麻醉對(duì)大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響；
　　 4、觀察米諾環(huán)素對(duì)異氟烷誘導(dǎo)的大鼠發(fā)育期神經(jīng)毒性的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1、凋亡神經(jīng)元統(tǒng)計(jì)和神經(jīng)元密度計(jì)算P7 Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，隨機(jī)分為

5、對(duì)照組（C組）和異氟烷麻醉組（A組）。A組大鼠35℃恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h。每組取3只大鼠，行動(dòng)脈血?dú)夥治?。每組各另取3只大鼠用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大腦皮層和海馬activecaspase-3陽性神經(jīng)元，計(jì)算陽性率。其余大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至出生后60 d后用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大腦NeuN表達(dá)，比較兩組大鼠皮層神經(jīng)元密度。
　　 2、觀察前炎癥因子mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)和IκBα蛋白變化P7 SD大鼠64只，隨機(jī)

6、分為對(duì)照組（C組）和異氟烷麻醉組（A組）。A組大鼠35℃
　　 恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h。A組于麻醉前（T0，基礎(chǔ)狀態(tài)）、麻醉2 h（T1）、4 h（T2）、6 h（T3）、麻醉停止后4 h（T4）、6 h（T5）、12 h（T6）、24 h（T7）時(shí)，C組在對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)各取4只大鼠，提取總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）
　　 測(cè)定海馬和皮層IL-1βmRNA、IL-6 m

7、RNA及TNF-αmRNA的表達(dá)水平。提取總蛋白，Western blot測(cè)定IκBα蛋白含量。
　　 3、水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力P7 SD大鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）和異氟烷麻醉組（A組）。A組大鼠35℃
　　 恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h。待大鼠麻醉蘇醒后，回籠繼續(xù)飼養(yǎng)至出生后60 d，行Morris Water Maze水迷宮實(shí)驗(yàn)。觀察大鼠在平臺(tái)隱藏實(shí)驗(yàn)和平臺(tái)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中的

8、差別。
　　 4、米諾環(huán)素對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的保護(hù)作用取新生SD大鼠皮層，神經(jīng)元原代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)5d后，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、異氟烷麻醉組（A組）、米諾環(huán)素1 μmol/L組（M1組）及米諾環(huán)素10 μmol/L組（M2組）。C組神經(jīng)元在37℃下空氣處理6 h，A組神經(jīng)元在37℃下用1.5％異氟烷處理6 h，M1和M2組神經(jīng)元分別在加入米諾環(huán)素1 μmol/L、10 μmol/L 10min后同A組一起進(jìn)行異氟烷處理。

9、相差顯微鏡下觀察4組神經(jīng)元形態(tài)，MTT檢測(cè)神經(jīng)元活性，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡。
　　 5、米諾環(huán)素對(duì)發(fā)育期大鼠的保護(hù)作用P7 SD大鼠45只，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、異氟烷麻醉組（A組）、米諾環(huán)素組（M組）。A組大鼠分別在35℃恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h，M組大鼠分別在麻醉前腹腔注射米諾環(huán)素45mg/kg后同A組一起麻醉。A組、M組于麻醉前（T0，基礎(chǔ)狀態(tài)）、麻醉2 h（T1）、4 h（T2）、6

10、 h（T3）、C組在對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)各取3只大鼠，提取總RNA，Real-time PCR測(cè)定海馬IL-1βmRNA、IL-6 mRNA及TNF-αmRNA的表達(dá)水平；提取T2 時(shí)間點(diǎn)總蛋白，Western blot測(cè)定IκBα蛋白含量。每組在T3各另取3只大鼠檢測(cè)大腦皮層active caspase-3陽性神經(jīng)元并計(jì)算陽性率。
　　 結(jié)果：
　　 1、凋亡神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)元密度A組大鼠皮層active caspase-3 陽性

11、神經(jīng)元數(shù)量明顯多于C組（P<0.05）。兩組大鼠海馬陽性神經(jīng)元數(shù)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組大鼠遠(yuǎn)期皮層神經(jīng)元密度相當(dāng)。
　　 2、前炎癥因子mRNA 動(dòng)態(tài)表達(dá)和IκBα蛋白變化C組各時(shí)點(diǎn)海馬IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；與C組比較，A組海馬T1~5時(shí)IL-1βmRNA表達(dá)上調(diào)，T2、T3 時(shí)IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)，T1~6 時(shí)TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.

12、05）。A組IκBα蛋白在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均較C組下降（P<0.05）。
　　 3、大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力在4天的訓(xùn)練過程中，兩組大鼠的尋臺(tái)潛伏期都進(jìn)行性縮短，但是兩組大鼠在尋臺(tái)潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、米諾環(huán)素對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的保護(hù)作用A組神經(jīng)元出現(xiàn)胞體腫脹、變形等改變；M1組神經(jīng)元形態(tài)與A組接近，M2組神經(jīng)元形態(tài)改變不明顯，與C組相近。MTT 結(jié)果顯示A組、M1組神經(jīng)元

13、活性低于C組、M2組（P<0.05）。A組、M1組凋亡神經(jīng)元數(shù)目明顯多于C組、M2組（P<0.05）。
　　 5、米諾環(huán)素對(duì)發(fā)育期大鼠的保護(hù)作用M組皮層神經(jīng)元凋亡明顯少于A組（P<0.05）。T1~3 IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表達(dá)均低于A組（P<0.05）。M組IκBα蛋白表達(dá)水平高于A組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、1.5％異氟烷麻醉6 h 能誘導(dǎo)發(fā)育期SD 大鼠