宮內(nèi)高糖環(huán)境對(duì)子代親源性基因印記的影響及其遺傳效應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分:妊娠期糖尿病小鼠傳代模型的建立及子代表型檢測(cè)
　　 目的:研究宮內(nèi)高糖環(huán)境出生小鼠子一代及子二代的生長(zhǎng)發(fā)育及糖代謝狀況,明確宮內(nèi)高糖環(huán)境所致成年期疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及隔代遺傳效應(yīng)。
　　 材料和方法:建立妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)小鼠傳代模型,子一代(F1-GDM)出生后由血糖正常的母鼠代為哺乳直至3周齡斷乳。檢測(cè)對(duì)照組(C)與F1-GDM出生體重、3周齡及8

2、周齡體重、胰腺比重；血糖儀檢測(cè)空腹及餐后隨機(jī)血糖水平并進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)；ELISA試劑盒檢測(cè)空腹及餐后胰島素水平；HE染色觀察胰島形態(tài),電鏡觀察胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu).將對(duì)照組及GDM出生子一代雌雄小鼠在性成熟期兩兩1:1自然交配,出生子二代小鼠(C♂-C♀,GDM♂-C♀,C♂-GDM♀,GDM♂-GDM♀),出生體重、3周齡及8周齡體重、胰腺比重、血糖、胰島素、胰島形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)同子一代.
　　 結(jié)果:宮內(nèi)高糖環(huán)境出生的子一代小

3、鼠出生體重顯著降低,經(jīng)過血糖正常的母鼠代為哺乳后,3周齡和8周齡的體重與對(duì)照組無(wú)顯著差異。雖然生長(zhǎng)早期(3周齡)糖耐量正常,但胰腺比重增加,透射電鏡顯示胰島細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂,在8周齡時(shí)出現(xiàn)糖耐量異常；子二代小鼠GDM♂-C♀及GDM♂-GDM♀組出生體重顯著增加,C♂-GDM♀出生體重?zé)o顯著改變,具有明顯的親源性遺傳效應(yīng),3周齡和8周齡的體重與對(duì)照組無(wú)顯著差異；但是在生長(zhǎng)早期(3周齡)就發(fā)生糖耐量異常,胰腺比重增加；透射電

4、鏡顯示3周齡時(shí)胰島細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂,至8周齡時(shí)胰島細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)有所修復(fù),然而8周齡時(shí)的糖耐量仍然異常。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),宮內(nèi)高糖環(huán)境出生的子一代和子二代雄鼠糖耐量異常表型均較雌鼠更加明顯。
　　 結(jié)論:宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子一代及子二代小鼠出生體重及糖代謝狀況異常,子代雄鼠糖耐量異常表型較雌鼠更加明顯；子一代父源性因素對(duì)子二代的生長(zhǎng)及糖代謝起主導(dǎo)作用,具有親源性遺傳特征,提示表觀遺傳機(jī)制可能在子代及隔代疾病發(fā)生中起重要

5、作用。
　　 第二部分:宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子代小鼠胰島功能、印記基因表達(dá)及甲基化狀況
　　 目的:研究宮內(nèi)高糖環(huán)境出生小鼠子一代及子二代的胰島功能、胰島細(xì)胞印記基因Igf2、H19及Plag11的表達(dá)以及Igf2／H19差異甲基化區(qū)(differentially methylatedregion,DMR)的甲基化狀況,分析胰島細(xì)胞發(fā)育及糖尿病發(fā)病相關(guān)印記基因的表達(dá)差異,評(píng)估宮內(nèi)高糖子代及隔代發(fā)生甲基化異常的風(fēng)險(xiǎn),探索胰島功

6、能、印記基因表達(dá)與甲基化的關(guān)系.
　　 材料和方法:用膽總管穿刺灌注膠原酶方法分離純化8周齡小鼠胰島細(xì)胞,體外葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰島功能,對(duì)與胰島細(xì)胞發(fā)育及糖尿病發(fā)病密切相關(guān)的印記基因Igf2、H19及Plag11行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。分離純化17日齡胎鼠胰島細(xì)胞,體外生理糖濃度或高糖環(huán)境培養(yǎng)24h后對(duì)印記基因?qū)崟r(shí)定量PCR檢測(cè)。采用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法檢測(cè)小鼠胰島Igf2 DMR0、Igf2 DMR1、Igf2 DM

7、R2和H19 DMR的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子一代及子二代小鼠胰島細(xì)胞表現(xiàn)為葡萄糖刺激后胰島素釋放功能受損,Igf2及H19基因表達(dá)均顯著低于對(duì)照組,Plag11基因表達(dá)無(wú)明顯改變；子一代和子二代雄鼠胰島印記基因表達(dá)異常均較雌鼠更加明顯。胎鼠胰島細(xì)胞經(jīng)體外高糖培養(yǎng)后,Igf2及H19基因表達(dá)均顯著低于對(duì)照培養(yǎng)組。對(duì)照組、F1-GDM及GDM♂-GDM♀中Igf2 DMR0的12個(gè)CpG位點(diǎn)、Igf2 DMR1

8、的4個(gè)CpG位點(diǎn)基本均為高甲基化,三組標(biāo)本間Igf2 DMR0和Igf2 DMR1的甲基化狀況相似。在對(duì)照組中,Igf2 DMR2的13個(gè)CpG位點(diǎn)和H19 DMR的12個(gè)CpG位點(diǎn)均表現(xiàn)為差異甲基化,而F1-GDM及GDM♂-GDM♀組中Igf2 DMR2和H19 DMR的甲基化程度均較對(duì)照組明顯增高。
　　 結(jié)論:宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子代小鼠胰島的葡萄糖刺激后胰島素釋放功能受損,是導(dǎo)致子代糖耐量異常表型的主要原因之一。印記基因I

9、gf2、H19表達(dá)降低,可能為胰島細(xì)胞功能異常的機(jī)制之一.宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子一代及子二代小鼠胰島Igf2／H19差異甲基化區(qū)中Igf2 DMR2和H19 DMR的甲基化水平較對(duì)照組增高,為印記基因Igf2、H19表達(dá)降低的主要機(jī)制。
　　 第三部分:官內(nèi)高糖環(huán)境出生子代小鼠胎盤基因組學(xué)及性腺印記基因表達(dá)
　　 目的:研究宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子一代及子二代小鼠胎盤基因表達(dá)譜與對(duì)照組是否存在差異,闡明其差異程度,分析宮內(nèi)高糖環(huán)境

10、出生子一代及子二代小鼠胎盤中印記基因的表達(dá)差異,并篩選關(guān)鍵性的差異基因。同時(shí)研究宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子一代小鼠性腺中印記基因表達(dá)狀況,分析子一代性腺中同源序列與人類印記疾病密切相關(guān)的印記基因的表達(dá)差異。
　　 材料和方法:應(yīng)用Affymetrix公司的Mouse Genome4302.0芯片,以對(duì)照組、F1-GDM及GDM♂-GDM♀組18日齡小鼠胎盤各3例為研究對(duì)象,利用芯片顯著性分析(significance analysis

11、of microarray,SAM)比較兩組標(biāo)本基因表達(dá),采用分層聚類、GO(gene ontology)分類及信號(hào)通路(pathway)分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)子一代及子二代各組胎盤差異表達(dá)的非印記及印記基因行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。對(duì)照組及宮內(nèi)高糖環(huán)境出生子一代8周齡(成年期)小鼠,雄鼠取睪丸,雌鼠取卵巢,選擇同源序列與人類印記疾病密切相關(guān)的印記基因行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果:采用sAM法得到對(duì)照組與F1-GD

12、M組之間差異最為顯著的124個(gè)基因,對(duì)照組與GDM♂-GDM♀組之間差異最為顯著的66個(gè)基因,對(duì)差異基因進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的分層聚類,可完全區(qū)分對(duì)照組、F1-GDM組和GDM♂-GDM♀組。根據(jù)分子功能、生物進(jìn)程及細(xì)胞組分進(jìn)行GO分析,顯示差異基因中包括與生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等相關(guān)的基因。Pathway分析發(fā)現(xiàn)差異基因涉及多條信號(hào)通路,包括與細(xì)胞黏附、營(yíng)養(yǎng)代謝、抗原呈遞等相關(guān)信號(hào)通路。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)12個(gè)非印記基因和12個(gè)印記基因在對(duì)照組和宮內(nèi)