宮內(nèi)缺氧對(duì)子代脂肪肝易感性的影響及其胰島素信號(hào)通路和RAS機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：近年來非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率升高。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素、遺傳因素、飲食因素或行為因素等并不能解釋NAFLD的全部病因。大量研究表明胎兒宮內(nèi)缺氧(prenatal hypoxia，PH)不僅會(huì)引起胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，還會(huì)造成胎兒重要組織器官的發(fā)育不良，以及成年后的代謝異常。PH對(duì)胎兒肝臟發(fā)育造成怎樣的影響，對(duì)子代成年后NAFLD易感性有怎樣的影響及其機(jī)制，

2、目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是重要內(nèi)分泌系統(tǒng)。近年來研究證實(shí)PH可影響RAS功能，且RAS與機(jī)體代謝調(diào)節(jié)特別是胰島素抵抗(insulin resistance，IRl密切相關(guān)。而PH對(duì)胎兒肝臟RAS的影響及其在成年子代NAFLD易感性改變的機(jī)制中的作用，國(guó)內(nèi)外均未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠及原代培養(yǎng)的胎羊肝細(xì)胞，分別從整體、組織器官、細(xì)胞、分子水平，就PH對(duì)成年子代N

3、AFLD易感性的影響機(jī)制及肝臟RAS在其中的作用進(jìn)行了研究。
　　 第一部分富內(nèi)缺氧對(duì)成年子代大鼠脂肪肝易感性的影響
　　 目的：觀察PH對(duì)子代大鼠肝臟發(fā)育及成年后NAFLD易感性的影響。方法：將妊娠大鼠從妊娠第4天至妊娠第21天(gestation day，GD4-21)放入缺氧環(huán)境飼養(yǎng)(O2濃度10±0.5％)，稱量胎鼠(GD21)、成年子代大鼠(6個(gè)月)及子代成年后經(jīng)短期缺氧(7天)大鼠的體重、肝臟重量；分別對(duì)上述

4、樣本肝臟進(jìn)行HE染色和蘇丹Ⅲ染色，光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)；電鏡觀察胎鼠肝臟的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：PH可顯著降低胎鼠的體重、肝臟重量及肝重系數(shù)，子代成年后這種情況均消失，但子代成年后再經(jīng)短期缺氧刺激，雄性大鼠肝重系數(shù)明顯升高。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示宮內(nèi)缺氧可使胎鼠肝細(xì)胞質(zhì)成分減少，特別是線粒體數(shù)量減少，嵴固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹斷裂，糖原顆粒增多；成年后表現(xiàn)為細(xì)胞的空泡化。蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示宮內(nèi)缺氧胎鼠及其成年子代再短期缺氧后，肝臟中有大量脂滴蓄積。結(jié)論：P

5、H能顯著影響胎肝發(fā)育，該影響可與成年后NAFLD易感性增加相關(guān)。
　　 第二部分宮內(nèi)缺氧增加子代大鼠脂肪肝易感性的機(jī)制研究
　　 目的：探討PH增加子代大鼠成年NAFLD易感性的胰島素信號(hào)通路機(jī)制，及PH對(duì)肝臟RAS的影響。方法：分別檢測(cè)胎鼠、成年子代大鼠及成年子代再經(jīng)短期缺氧大鼠的空腹血糖、血漿胰島素及甘油三酯、總膽固醇水平，并計(jì)算胰島素敏感性系列指數(shù)；檢測(cè)其肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平；檢測(cè)其血漿和肝組織勻漿中血

6、管緊張素Ⅰ(angiotoninⅠ，AngⅠ)、血管緊張素Ⅱ(angiotoninⅡ，AngⅡ)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)水平。結(jié)果：PH可導(dǎo)致胎鼠胰島β細(xì)胞功能受損，血漿胰島素水平下降，機(jī)體胰島素敏感性增高，肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporters2，Glut2)增加，血糖降低；子代成年后胰島素敏感性降低，肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白

7、表達(dá)明顯低于正常子代；PH成年子代再缺氧后，血糖顯著增高，胰島素敏感性降低更為明顯，肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)雖因缺氧應(yīng)激而增高，但增高幅度顯著低于正常子代，且Glut2甚至較缺氧刺激前顯著下降；PH胎鼠及成年子代大鼠與正常對(duì)照組比較血漿AngⅠ、AngⅡ、ACE水平無顯著差異，而肝臟中AngⅡ含量顯著增加；成年子代再經(jīng)缺氧刺激后，PH大鼠血漿AngⅡ含量、肝臟中AngⅠ、AngⅡ含量均顯著增高，肝臟中的ACE含量也顯著高于缺氧前和正常

8、子代缺氧后。結(jié)論：引起子代大鼠成年IR是PH增加子代NAFLD易感性的機(jī)制之一。成年后的IR恰恰是其胎兒期胰島素敏感性增高的“印跡”效應(yīng)。PH可使子代肝臟組織局部RAS激活，循環(huán)RAS對(duì)缺氧刺激敏感性增高。
　　 第三部分缺氧對(duì)原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的影響及RAS在其胰島素信號(hào)通路中的作用機(jī)制
　　 目的：觀察缺氧對(duì)原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和其胰島素信號(hào)通路的影響及RAS在其中的作用。方法：采用臍靜脈Ⅳ型膠原酶灌注法

9、和Percoll梯度離心法分離胎羊肝細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞性狀和純度。繪制原代培養(yǎng)胎羊肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，選擇最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間。用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞AT1、AT2的存在、分布、豐度。建立肝細(xì)胞缺氧損傷模型，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧對(duì)胎羊肝細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡的影響；利用透射電鏡觀察缺氧對(duì)胎肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響；檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中AngⅠ、AngⅡ、ACE含量。將AngⅡ、Losartan(AT1

10、阻斷劑)、PD123319(AT2阻斷劑)分別作用于缺氧處理和正常對(duì)照胎羊肝細(xì)胞，利用Western-blot方法檢測(cè)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：經(jīng)過鑒定，確定我們成功分離和培養(yǎng)了純度>95％的胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其細(xì)胞膜上普遍具有豐富的AngⅡ受體AT1和AT2。缺氧可使原代培養(yǎng)的胎肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞S期細(xì)胞比率和細(xì)胞增殖指數(shù)增高，同時(shí)凋亡細(xì)胞比率也隨缺氧時(shí)間而遞增；缺氧24h后細(xì)胞數(shù)量逐步下降。缺氧組原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的線粒體

11、腫脹、基電子密度高，嵴排列紊亂固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞漿內(nèi)現(xiàn)大量脂滴。缺氧細(xì)胞培養(yǎng)基中AngⅠ、AngⅡ較正常組均顯著升高，ACE含量無差異。缺氧組原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與正常對(duì)照組比較，胰島素信號(hào)通路蛋白均降低，而Glut2表達(dá)略有增加趨勢(shì)。阻斷AT1或阻斷AT2后，胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)均進(jìn)一步下降，Glut2表達(dá)也明顯下降，且阻斷AT1組下降幅度大于加入阻斷AT2組；加入AngⅡ(同時(shí)興奮AT1和AT2)的原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞胰島素

12、信號(hào)通路蛋白均顯著增高，Glut2表達(dá)顯著增加；單獨(dú)興奮AT2和單獨(dú)興奮AT1，胰島素信號(hào)通路蛋白和Glut2表達(dá)的量增加，但均無同時(shí)興奮AT1/AT2增加顯著。結(jié)論：原代培養(yǎng)高純度的胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞保持了原有細(xì)胞特性。缺氧可誘導(dǎo)胎肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖，以代償由于缺氧而損失(凋亡或壞死)的細(xì)胞，同時(shí)引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷及AngⅠ、AngⅡ分泌增加。RAS參與了PH導(dǎo)致的胎肝代謝異常及胰島素信號(hào)通路激活，該過程由AT1和AT2協(xié)同作用，AT1占主