RUNX3和β-catenin在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中的表達(dá)及作用.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌80％以上由腺瘤癌變而來，結(jié)直腸腺瘤的75％～80％為管狀腺瘤，臨床上結(jié)直腸癌由散發(fā)性管狀腺瘤癌變而來的病例并不少見，但其癌變機(jī)制尚不明確。
　　 近年來，表觀遺傳學(xué)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系成為醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)之一，其中DNA甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系也受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。RUNX3是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，是哺乳動物RUNX家族成員，是該家族進(jìn)化的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路的重

2、要因子之一，可指導(dǎo)TGF-β/smad復(fù)合物從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)特定靶位點(diǎn)，加強(qiáng)Smad復(fù)合物與靶位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度并激活靶基因，從而參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡等生物學(xué)行為，同時RUNX3與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，在許多腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)機(jī)制主要為甲基化。
　　 Wnt通路在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，β-catenin是其重要成員。β-catenin作為一種多功能蛋白，具有細(xì)胞粘附和信號傳導(dǎo)功能，一是與E-鈣

3、黏蛋白連接形成E-Cadherin-β-catenin功能復(fù)合體，介導(dǎo)細(xì)胞的粘附；二是作為信號分子參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生。正常細(xì)胞胞漿中游離的β-catenin水平較低，但當(dāng)APC、β-catenin或axin發(fā)生基因突變時可導(dǎo)致β-catenin胞漿積聚并異位到細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生。
　　 Ito等研究發(fā)現(xiàn)RUNX3能與β-catenin/TCF4（T細(xì)胞因子4，TCF4

4、）形成三元絡(luò)合物，減弱β-catenin/TCF4復(fù)合物與DNA結(jié)合的親和力，下調(diào)β-catenin/TCF4復(fù)合物下游靶基因表達(dá)，從而減弱Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。
　　 結(jié)直腸管狀腺瘤上皮異型增生和癌變往往呈局灶性分布，激光捕獲顯微切割（LCM）方法能快速、準(zhǔn)確切割和分離異型增生和癌變細(xì)胞，有效克服細(xì)胞異質(zhì)性造成的偏差。目前有關(guān)采用LCM技術(shù)進(jìn)行結(jié)直腸管狀腺瘤異型增生和癌變的研究以及探討RUNX3和β-catenin在散發(fā)性

5、結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中的意義及相關(guān)性研究尚未見報(bào)導(dǎo)。為進(jìn)一步探討散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變機(jī)制，以激光捕獲顯微切割技術(shù)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)、Western blot、RT-PCR及甲基化特異性PCR的研究方法，分析正常大腸粘膜、伴有不同程度異型增生的散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤和腺瘤癌變中RUNX3和β-catenin的表達(dá)情況，同時探討兩者的相關(guān)性以期揭示二者在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變中的可能作用，為結(jié)直腸腺瘤癌變的防治奠定理論基

6、礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、免疫組織化學(xué)方法
　　 采用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus兩步法，檢測了23例正常大腸粘膜、81例散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤伴異型增生病例和20例腺瘤癌變病例中RUNX3及β-catenin蛋白的表達(dá)情況。
　　 2、蛋白免疫印跡(Western blot)
　　 用Western blot方法檢測了17對新鮮結(jié)直腸腺瘤癌變組織及相應(yīng)正常大腸粘膜內(nèi)RUNX3及β

7、-catenin的表達(dá)情況。勻漿法提取組織總蛋白，經(jīng)15％SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上，5％脫脂奶封閉1.5小時。一抗（RUNX31:200;β-catenin1:400）4℃過夜，二抗(1:8000)37℃孵育1.5h，ECL顯色。Snygene全自動凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)，以RUNX3、β-catenin與內(nèi)參照GAPDH的比值分別表示其相對表達(dá)量。
　　 3、RT-PCR應(yīng)用
　　 RT-PC

8、R檢測了17對新鮮結(jié)直腸腺瘤癌變組織及相應(yīng)正常大腸粘膜內(nèi)RUNX3mRNA的表達(dá)。采用Trizol液氮研磨法提取組織總RNA，1％瓊脂糖電泳鑒定其完整性，并經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測。取500ng總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果采用凝膠分析軟件(BIO-LD)進(jìn)行定量分析，以RUNX3與內(nèi)參照基因β-actin的比值來表示其相對表達(dá)量。
　　 4、甲基化特異性PCR(MSP)
　　

9、 4.1激光捕獲顯微切割(LCM)17對新鮮結(jié)直腸腺瘤癌變組織和相應(yīng)正常大腸粘膜組織及41例石蠟管狀腺瘤伴不同程度異型增生組織行10μm切片，貼于LCM專用薄膜載片(Leica公司)上。應(yīng)用Leica6000 LMD系統(tǒng)行顯微切割，所得組織進(jìn)行DNA甲基化研究。
　　 4.2甲基化特異性PCR(MSP)依照Qiagen公司MicroDNA提取試劑盒說明書抽提顯微切割所得組織DNA，將DNA進(jìn)行焦亞硫酸鈉及氫醌處理，處理后的DN

10、A于-20℃冰箱備用。設(shè)計(jì)RUNX3基因的甲基化引物和非甲基化引物并進(jìn)行PCR檢測。Snygene全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察分析RUNX3甲基化情況。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)，兩相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)）及spearman相關(guān)分析法。P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 RUNX3在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中的

11、表達(dá)情況
　　 1.1 RUNX3蛋白的表達(dá)情況
　　 1.1.1免疫組織化學(xué)結(jié)果：在正常大腸粘膜、管狀腺瘤伴上皮異型增生及腺瘤癌變組中RUNX3陽性表達(dá)率分別為91.30％(21/23)、54.32％(44/81)和15.00％(3/20)。腺瘤伴上皮異型增生和腺瘤癌變組中RUNX3的陽性表達(dá)率明顯低于正常大腸粘膜組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。管狀腺瘤癌變組RUNX3陽性表達(dá)率明顯低于管狀腺瘤伴異型增生組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。管狀腺瘤伴

12、上皮輕、中、重度異型增生組中RUNX3的陽性表達(dá)率分別為75.76％(25/33)（Ⅰ級）、60.87％(14/23)（Ⅱ級）和20.00％(5/25)（Ⅲ級），重度異型增生組RUNX3陽性表達(dá)率明顯低于輕、中度異型增生組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中度異型增生組RUNX3陽性表達(dá)率低于輕度異型增生組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.1.2蛋白免疫印跡(Western blot)結(jié)果：RUNX3蛋白分子量為45～46KD，以GAPDH(34

13、KD)為內(nèi)參照，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶進(jìn)行定量。統(tǒng)計(jì)分析表明，散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變組織內(nèi)RUNX3蛋白表達(dá)顯著低于相應(yīng)正常大腸粘膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.2 RUNX3 mRNA在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變組織與相應(yīng)正常大腸粘膜中的表達(dá)：17對結(jié)直腸管狀腺瘤癌變組織及相應(yīng)正常大腸粘膜中均可見RUNX3mRNA表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析表明，管狀腺瘤癌變組織RUNX3 mRNA表達(dá)量顯著低于相應(yīng)正常粘膜組織，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

14、r>　　 1.3 RUNX3在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中甲基化情況
　　 1.3.1激光捕獲顯微切割結(jié)果：17對結(jié)直腸管狀腺瘤癌變組織的癌巢與相應(yīng)正常大腸粘膜以及41例石蠟腺瘤組織的腺體被完整的從間質(zhì)細(xì)胞中分離出來，切割后的目的細(xì)胞完全從切片上落入eppendorf管管帽上，無雜合細(xì)胞成分。
　　 1.3.2 RUNX3 DNA甲基化的檢測結(jié)果：甲基化特異性PCR(MSP)結(jié)果：RUNX3在正常大腸粘膜、管狀腺瘤伴

15、異型增生組織及管狀腺瘤癌變組織中甲基化率分別為5.89％(1/17)、17.07％(7/41)和41.18％(7/17)。腺瘤癌變組織中RUNX3基因甲基化陽性率明顯高于正常粘膜組及腺瘤伴異型增生組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。管狀腺瘤伴上皮異型增生組中RUNX3甲基化率高于正常粘膜組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)直腸管狀腺瘤伴上皮輕、中、重度異型增生組織的RUNX3甲基化率分別為13.33％(2/15)（Ⅰ級）、16.67

16、％(2/12)(Ⅱ級)、21.43％(3/14)（Ⅲ級），甲基化率隨異型程度增高而升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.4 RUNX3甲基化與RUNX3蛋白及mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析在17例管狀腺瘤癌變病例中，RUNX3發(fā)生甲基化病例的RUNX3蛋白及mRNA表達(dá)明顯低于未發(fā)生甲基化的病例，差異有顯著性。
　　 2β-catenin在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中的表達(dá)情況
　　 2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果：正常大腸粘膜

17、、管狀腺瘤伴上皮異型增生及管狀腺瘤癌變組織中β-catenin蛋白陽性表達(dá)率分別為13.04％(5/23)、60.49％(49/81)和90.00％(18/20)。管狀腺瘤伴上皮異型增生和管狀腺瘤癌變組中β-catenin陽性表達(dá)率明顯高于正常大腸粘膜組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。管狀腺瘤癌變組中β-catenin陽性表達(dá)率明顯高于管狀腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在管狀腺瘤伴輕、中、重度異型增生組中β-catenin陽性表達(dá)率分別為39.40％(13

18、/33)（Ⅰ級）、65.21％(15/23)（Ⅱ級）、84.00％(21/25)（Ⅲ級），重度異型增生組β-catenin陽性表達(dá)率顯著高于輕度異型增生組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度異型增生組β-catenin陽性表達(dá)率高于中度異型增生組，中度異型增生組高于輕度異型增生組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.2蛋白免疫印跡(Western blot)結(jié)果：β-catenin蛋白分子量約為92KD，以GAPDH(34KD)為內(nèi)參照，經(jīng)圖像分析系

19、統(tǒng)對雜交條帶進(jìn)行定量。統(tǒng)計(jì)分析表明，管狀腺瘤癌變組織內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)顯著高于相應(yīng)正常大腸粘膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、RUNX3、β-catenin在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中的相關(guān)性相關(guān)分析顯示，在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中RUNX3和β-catenin無明顯相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、在散發(fā)性結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中，RUNX3蛋白及mRNA的表達(dá)逐漸降低。