尼古丁暴露對(duì)成年昆明小鼠大腦內(nèi)APP和Presenilin 1表達(dá)的影響.pdf

1、背景及目的
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙及人格改變等,常發(fā)生于老年和老年前期。AD的主要病理學(xué)特征為淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)裂解生成的淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積于腦內(nèi)形成的老年斑(senile plaque,SP)、腦血管內(nèi)淀粉樣沉淀和

2、大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,NFT)并伴隨神經(jīng)元數(shù)量減少,大多學(xué)者認(rèn)為AD與腦內(nèi)Aβ的沉積有密切聯(lián)系,但詳細(xì)發(fā)病機(jī)制仍不清楚。AD有家族性和散發(fā)性兩種,到目前為止已確定與AD有關(guān)的基因共有4個(gè),分別是載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)、淀粉樣前體蛋白(APP)、早老素1(Presenilin 1,PS1)和早老素2(Presenilin 2,PS2)基因,其中APP和PS1是目

3、前認(rèn)為與AB產(chǎn)生直接相關(guān)的兩個(gè)蛋白,APP是Aβ產(chǎn)生的“原材料”,PS1是組成切割A(yù)PP的γ-分泌酶的核心活性成分。近年來,有學(xué)者經(jīng)臨床病例及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)AD患者都存在APP和PS1的過表達(dá),并且對(duì)敲除PS1基因的小鼠進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)γ-分泌酶活性降低80％,Aβ含量大大降低。
　　 目前,臨床上廣泛使用中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿酯酶抑制劑對(duì)AD患者進(jìn)行治療以延緩患者因腦中大量膽堿能神經(jīng)元缺失而出現(xiàn)的各種癥狀,但這只是一種治標(biāo)不治

4、本的療法。所以,研究人員根據(jù)Aβ在AD發(fā)生過程中的主軸作用及Aβ的產(chǎn)生過程提出在對(duì)AD的預(yù)防與治療方面,應(yīng)以干預(yù)Aβ的產(chǎn)生為根本目的,因而提出了包括抑制Aβ的聚集及毒性,加速Aβ的代謝,抑制APP的表達(dá),調(diào)節(jié)APP的酶解通路以減少Aβ形成(如上調(diào)α-分泌酶活性,降低γ-分泌酶活性)等多種方案,從已有的研究結(jié)果看,下調(diào)APP的表達(dá)和降低γ-分泌酶活性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)也最具治療應(yīng)用前景,但相關(guān)抑制劑的過度抑制也一直困擾著研究人員,所以尋找適

5、度的抑制劑成了主要的任務(wù)。
　　 尼古丁(Nicotine),又名煙堿,是煙草中的主要生物堿,流行病學(xué)家發(fā)現(xiàn)吸煙人群中AD的發(fā)生率顯著低于正常人群,尼古丁是降低AD發(fā)病率的主要成份,并且已有研究還發(fā)現(xiàn)尼古丁暴露可以降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)和腦血管Aβ的沉積。因此,本研究建立在尼古丁暴露小鼠動(dòng)物模型的基礎(chǔ)之上來研究尼古丁暴露對(duì)小鼠腦內(nèi)APP和PS1表達(dá)是否有抑制作用。
　　 材料和方法
　　 一、動(dòng)物分組與尼古丁暴

6、露小鼠模型的制備
　　 SPF級(jí)雄性成年昆明種小鼠60只,體重30±5g,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為對(duì)照(Con),生理鹽水(Sal)、實(shí)驗(yàn)一(Tes1),實(shí)驗(yàn)二(Tes2)和實(shí)驗(yàn)三(Tes3)5組,中國醫(yī)科大學(xué)發(fā)育生物學(xué)教研室SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組每天背部皮下注射生理鹽水稀釋的尼古丁溶液0.1ml(Sigma),尼古丁注射總量為3mg/kg,Con正常飼養(yǎng),Sal組每日同時(shí)注射等量生理鹽水,T1給藥10天,T

7、2給藥20天,T3給藥40天,建立尼古丁暴露模型。實(shí)驗(yàn)各組及生理鹽水組分別在給藥結(jié)束當(dāng)天處死6只取腦,無菌0.01M PBS沖洗后-70℃凍存；另外6只經(jīng)灌流后取腦,經(jīng)固定、脫水、透化后石蠟包埋并連續(xù)切片。
　　 二、檢測成年昆明小鼠大腦內(nèi)APP和PS1表達(dá)的變化
　　 1、RT-PCR方法檢測小鼠大腦內(nèi)APP和PS1 mRNA表達(dá)情況。
　　 2、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot)方法檢測小鼠大腦內(nèi)AP

8、P和PS1表達(dá)情況。
　　 3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測PS1在小鼠大腦內(nèi)分布的部位。
　　 結(jié)果
　　 一、RT-PCR方法檢測結(jié)果
　　 Tes1組、Tes2組、Tes3組中PS1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(p<0.05)；Tes1組、Tes2組、Tes3組中APP mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比未見顯著差異。
　　 二、Western blot方法檢測結(jié)果
　　 Te

9、s1組、Tes2組、Tes3組中PS1表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低(p<0.05)；Tes1組、Tes2組、Tes3組中APP的表達(dá)水平與對(duì)照組相比未見顯著差異。
　　 三、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　 在對(duì)照組中可見大量PS1陽性細(xì)胞分布于大腦皮層、海馬齒狀回內(nèi)板和齒狀回多形層及兩者之間的神經(jīng)纖維也有成團(tuán)塊狀的陽性物分布、海馬的細(xì)胞層也可見有呈棕褐色著色的陽性細(xì)胞分布,第三腦室周圍的下丘腦弓狀核、結(jié)節(jié)乳頭體腹側(cè)核、乳頭體

10、外側(cè)核、乳頭體前核和乳頭體內(nèi)核也有許多陽性細(xì)胞分布；實(shí)驗(yàn)組僅見第三腦室周圍的下丘腦弓狀核、結(jié)節(jié)乳頭體腹側(cè)核、乳頭體外側(cè)核、乳頭體前核和乳頭體內(nèi)核部位有PS1陽性細(xì)胞分布。
　　 結(jié)論
　　 1、尼古丁暴露對(duì)成年昆明小鼠大腦內(nèi)APP的表達(dá)未見有影響。
　　 2、尼古丁暴露可以抑制成年昆明小鼠大腦皮層、海馬細(xì)胞層、海馬齒狀回內(nèi)板和齒狀回多形層及兩者之間纖維區(qū)域中PS1的表達(dá)。
　　 3、尼古丁暴露對(duì)第三腦室周