環(huán)境雌激素雙酚A對成年小鼠學習記憶和突觸結構的影響.pdf

1、雙酚A(bisphenol A，BPA)大量使用于食品和飲料的碳酸聚酯包裝材料、樹脂內(nèi)膜和牙齒固封劑，以及各種化學日用品的添加材料。來自一些發(fā)達國家的調(diào)查顯示長期以來人們一直暴露于低劑量的BPA中。美國疾病控制中心的報告顯示，來自394份被測人群尿液樣本中有95％檢測出BPA。BPA是一種兼有擬雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，它不僅可以低親和性與雌激素受體結合，還可與雄激素受體結合而干擾內(nèi)源性激素對腦的調(diào)節(jié)作用。目前大

2、部分關于BPA的研究大多集中在圍生期和發(fā)育期，對成年期的研究還很少，并且本實驗室前期工作表明，圍生期和青春期BPA暴露影響子代小鼠的學習記憶、情感和多種社會行為及其性別分化。因此本研究將探討B(tài)PA暴露對成年期小鼠的影響。
　　海馬的突觸可塑性與學習記憶行為密切相關，雌激素可通過正向調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、神經(jīng)環(huán)路聯(lián)系和突觸傳遞而促進突觸可塑性。最近，有人發(fā)現(xiàn)BPA可以干擾性激素的突觸重塑作用。在大鼠和靈長類，BPA可抑制雌激素和雄激素誘導增

3、加的海馬和前皮層70-100％的棘突觸，BPA暴露數(shù)天促進新生大鼠小腦蒲肯野氏細胞的樹突生長和下丘腦神經(jīng)元樹突密度。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)BPA快速增加體外海馬神經(jīng)元樹突絲密度和運動性。突觸界面是一個對行為訓練和化學物質非常敏感的結構，其中的一些參數(shù)，如突觸間隙(synaptic cleft)、突觸前活性帶(synaptic activezone)、突觸后致密體(postsynaptic density, PSD)和突觸界面曲率(curva

4、ture of synaptic interface)可因刺激而發(fā)生改變。雌激素改善卵巢摘除小鼠記憶行為的同時伴隨有海馬和前皮層突觸界面結構的變化，包括突觸間隙的縮小和PSD厚度增加。位于突觸后膜上的PSD含有細胞骨架和腳手架蛋白、谷氨酸受體、鈣調(diào)蛋白結合蛋白、離子通道和信號分子等多種蛋白，這些蛋白表達的改變和相互作用均可影響突觸活性和可塑性，同時也改變PSD的厚度。那么，BPA影響成年神經(jīng)行為是否與突觸界面結構修飾的改變有關呢？

5、>　　本研究通過將成年小鼠長期暴露于低劑量BPA，研究BPA對成年小鼠活動性、探究、學習記憶等行為的影響，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸密度和突觸界面結構的改變;進一步通過Western blot檢測海馬突觸蛋白SynapsinⅠ和PSD-95(postsynaptic density protein of 95 kDa)，以及興奮性氨基酸NMDA和AMPA受體表達的改變，探討B(tài)PA影響行為和突觸結構可塑性的機制。
　　方法:清潔級8

6、周齡ICR雌雄小鼠，雄性體重30-35g，雌性體重25-30g，購于浙江省金華市藥檢所。小鼠雌雄分開飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12h交替，飼養(yǎng)室溫度控制在18-22C，濕度在50％-60％，水和食物自由攝取。小鼠適應2周后，隨機分為BPA暴露組(0.4，4，40mg/kg/day)(BPA，99.8％，上海生工生物工程技術服務有限公司)和溶媒對照組（金龍魚食用油）。每天上午8點灌胃染毒，持續(xù)12周。染毒結束3天后，按順序分別檢測開場行為，水迷

7、宮和被動回避。另取小鼠進行分別做超薄切片電鏡觀察海馬突觸界面結構、蛋白免疫印跡(western-blot)技術檢測海馬NMDA受體NR1和AMPA受體GluR1亞基表達和突觸蛋白PSD-95和Synapsin-1表達;同時檢測體重、血清雌激素、雄激素水平。
　　所得的數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，采用SPSS18.0軟件包，水迷宮四天訓練結果采用重復三因素(BPA暴露×性別×訓練天數(shù))方差分析(three-way ANOVA)，其它行

8、為結果、體重和突觸形態(tài)測算采用重復雙因素(BPA暴露×性別)方差分析(two-way ANOVA)，生殖器官系數(shù)、血清激素水平和Western blot結果用單因素(BPA暴露)方差分析(one-way ANOVA)。然后進行事后檢驗(Post-hoc test，LSD)。P＜0.05作為具有統(tǒng)計學差異顯著性。
　　結果:
　　1.BPA暴露前(10周齡)小鼠體重沒有明顯的性別差異，隨后，雄鼠的體重增長加速，到22.5周齡時

9、，雄鼠體重明顯高于雌鼠，與同性別對照組相比，0.4和40 mg/kg/day BPA暴露12周顯著增加雄鼠的體重(p＜0.05)。BPA暴露對雌、雄小鼠生殖器官/體重比、雌鼠血清和腦內(nèi)雌二醇水平均沒有顯著影響，但0.4和4 mg/kg/day BPA顯著降低雄鼠血清和腦的睪酮水平(p＜0.05)。
　　2.開場行為結果表明:一分鐘跑格數(shù)雌雄組內(nèi)均沒有差異，而雄性在一分鐘跑格數(shù)據(jù)中顯著高于雌性(0，0.4，40mg/kg/d，p＜0

10、.05)，而測試五分鐘跑格數(shù)得出，雌雄小鼠組內(nèi)組間都沒有差異，BPA暴露消除了小鼠在五分鐘跑格數(shù)中的性別差異。BPA暴露(0.4、4、40mg/kg/day)增加雄性的站立次數(shù)和理毛頻率，BPA(4mg/kg/day)卻顯著減少雌鼠的站立次數(shù)。在4天的水迷宮訓練中，各組小鼠的游泳平均速度沒有明顯差異，但每天探索平臺的平均距離表現(xiàn)為隨訓練天數(shù)的增加而縮短，說明各組小鼠都具有一定的空間學習和記憶能力，但正常雌鼠探索平臺所需的平均距離要大于雄

11、鼠(第3、4天，P＜0.05)，表明正常狀態(tài)下雄鼠具有更好的空間學習記憶能力。BPA暴露顯著延長雄鼠搜索平臺的平均距離(P＜0.05），但對雌鼠沒有影響。表明長期BPA暴露性別特異性地損傷成年雄鼠的空間記憶能力，并因此消除空間學習記憶的性別差異。跳臺實驗結果顯示:電擊前，各組小鼠步下平臺的潛伏期沒有差異，均可在5sec內(nèi)跳下平臺。電擊后24h，各組小鼠步下平臺潛伏期均顯著延長，并表現(xiàn)出性別差異(P＜0.001，雄鼠＞雌鼠)。與同性別對照

12、組相比，40mg/kg/day BPA明顯縮短了雄鼠電擊后的步下潛伏期(P＜0.05）;表明長期BPA暴露性別特異性地損傷成年雄鼠的被動回避記憶能力，并因此消除其性別差異。
　　3.突觸數(shù)密度和突觸界面結構參數(shù)檢測結果顯示0.4和40mg/kg/day BPA暴露顯著降低了雄鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)密度（P＜0.01），并因此誘導成年小鼠海馬CA區(qū)突觸密度的性別差異(P＜0.01，雄鼠＜雌鼠)。與同性別對照組相比，BPA顯著加寬雄鼠海

13、馬的突觸間隙寬度(P＜0.05，P＜0.01)，縮短其活性帶長度(0.4mg/kg/day，P＜0.05)，并減小PSD厚度(0.4、40mg/kg/day，P＜0.05)，但對雌鼠沒有影響。以上結果表明長期BPA暴露主要影響成年雄鼠的突觸形成和結構修飾，該結果與BPA對記憶行為的影響相一致。
　　4.進一步分析BPA損傷學習記憶和突觸形成的機制，本研究采用Westernblot分析了長期BPA暴露后，海馬突觸標志性蛋白和谷氨酸N

14、MDA和AMPA受體表達的變化。結果表明，BPA暴露性別特異性地抑制突觸蛋白和受體的表達，主要表現(xiàn)為3個劑量BPA均下調(diào)雄鼠SynapsinⅠ和PSD-95表達(P＜0.05，P＜0.01)，0.4和40mg/kg/day BPA下調(diào)NMDA受體NR1亞基表達(P＜0.05，P＜0.01)，但對雌鼠的這些蛋白沒有明顯影響。以上結果提示成年雄鼠海馬的突觸蛋白和NMDA受體對BPA更為敏感，該結果與BPA引起的突觸形成和結構變化相一致的。<