環(huán)境雌激素對(duì)小鼠生殖系統(tǒng)雄激素受體影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:流行病學(xué)研究顯示近幾十年來男性生殖系統(tǒng)畸形發(fā)生率明顯增高[1],且與胎兒期母體及胎兒的環(huán)境雌激素(environmentl estrogens,EEs)暴露有關(guān),但EEs對(duì)生殖系統(tǒng)發(fā)育影響的機(jī)理卻很不清楚。近來研究表明,生殖股神經(jīng)(genitofemoral nerve,GFN)接受睪丸分泌的雄激素的影響,并通過其神經(jīng)纖維釋放神經(jīng)遞質(zhì)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)作用于

2、睪丸引帶,使睪丸引帶產(chǎn)生收縮和運(yùn)動(dòng)效應(yīng),從而參與調(diào)節(jié)睪丸的下降[2]。形成了新的調(diào)節(jié)睪丸下降發(fā)育的“睪丸-GFN-睪丸引帶”軸。環(huán)境雌激素會(huì)對(duì)生殖系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響,其機(jī)理復(fù)雜,是否通過了對(duì)該軸(途徑)的影響目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬采用公認(rèn)的代表性EEs己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)作用于孕期母鼠,通過檢測(cè)不同發(fā)育階段雄性仔鼠中睪丸、睪丸引帶以及位于脊髓前角的生殖股神經(jīng)細(xì)胞中雄激素受體的變化情況以了解EEs是否會(huì)

3、對(duì)這條影響睪丸下降和發(fā)育的途徑產(chǎn)生影響。
　　材料和方法:8~10周齡健康雌性昆明小鼠120只隨機(jī)分為8組:實(shí)驗(yàn)組1-6分別給予DES0.1、0.5、10.0、25.0、50.0、100.0μg.kg-1.d-1。對(duì)照組僅給予DMSO和NS;正常組不給任何藥物。小鼠按雌雄比例2:1合籠,以檢查發(fā)現(xiàn)陰栓作為受孕標(biāo)志,定為妊娠第0天,記為GD0(gestation day,GD)。GD9至GD17上午8時(shí)皮下注射給藥,每組所用的DES

4、均溶于等量的DMSO及NS中,以保證每次每只小鼠每千克體重給予相同量的DMSO和NS。以小鼠出生當(dāng)天記為生后0天,計(jì)為PD0(postnatal day,PD)。分別于GD17、GD19、PD0、PD3、PD7時(shí)取材:上腹部橫斷,取下半部分用10％福爾馬林固定、取材。作4μm厚冠狀位連續(xù)切片進(jìn)行常規(guī)HE染色觀察和特殊的免疫組織化學(xué)研究。光鏡觀察睪丸、睪丸引帶及脊髓前角的組織結(jié)構(gòu)變化,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組睪丸、睪丸引帶及脊髓前角生殖股

5、神經(jīng)(GFN)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞中的雄激素受體(androgen receptor, AR)表達(dá)情況,測(cè)定各部位AR指標(biāo)的陽性灰度值,以Χ±s表示,采用SPSS for windows10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多個(gè)處理組與一個(gè)對(duì)照組比較的方差分析方法進(jìn)行比較,并采用相關(guān)分析和回歸分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),而不同劑量及不同發(fā)育階段小鼠睪丸、睪丸引帶、脊髓前角AR含量的變化情況則采用t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:1.顯微形態(tài)學(xué)觀察:
　?、俨G丸:正常組、對(duì)

6、照組睪丸的生精小管形態(tài)正常,但在100.0和50.0μg.kg-1.d-1組出現(xiàn)睪丸生精細(xì)胞層減少、稀疏,睪丸生精細(xì)胞脫落至管腔;睪丸生精上皮出現(xiàn)多核細(xì)胞。
　?、诓G丸引帶:a,正常組及對(duì)照組睪丸引帶發(fā)育良好,引帶球呈類圓形由兩部分構(gòu)成:中心為間葉組織,外周為肌細(xì)胞,兩者之間分界清楚;DES處理組可見睪丸引帶發(fā)育不良,形態(tài)不規(guī)則,間葉組織與肌層細(xì)胞之間無明顯分界,組織結(jié)構(gòu)紊亂,DES劑量越大,結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象越明顯;b,GD17時(shí)睪丸

7、引帶呈類圓型,體積大,隨年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增大變圓后縮小退化的趨勢(shì)。PD7時(shí)大部分睪丸引帶已經(jīng)退化,僅剩余形態(tài)不規(guī)則的纖維結(jié)蒂組織。
　?、奂顾枨敖?a,正常組、對(duì)照組及低劑量實(shí)驗(yàn)組的脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量上無明顯差異,但在50.0和100.0μg.kg-1.d-1組出現(xiàn)GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、稀疏、細(xì)胞體積增大、不規(guī)則;b,GD19時(shí)脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞密集,形態(tài)規(guī)則,隨著天數(shù)增加,其數(shù)量逐漸減少,細(xì)胞體

8、積增大。P7D時(shí)細(xì)胞數(shù)量減少明顯,體積增大。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測(cè):
　　①在正常組和對(duì)照:a,睪丸AR出生前表達(dá)較弱,出生后表達(dá)迅速增強(qiáng),有隨年齡增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì);b,睪丸引帶AR出生前隨睪丸引帶的生長(zhǎng)而表達(dá)迅速增加,出生后隨睪丸引帶逐漸退化而迅速減少;c,脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞AR出生前隨睪丸引帶的生長(zhǎng)而表達(dá)迅速增加,出生后隨睪丸引帶逐漸退化而迅速減少。
　　②在相同發(fā)育階段不同劑量DES影響下,睪丸、睪丸

9、引帶及脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞AR的表達(dá)呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì):低劑量實(shí)驗(yàn)組(DES0.1和0.5μg.kg-1.d-1組)AR灰度值與正常組、對(duì)照組比較變化不明顯(P>0.05),中、高劑量實(shí)驗(yàn)組(DES10.0、25.0μg.kg-1.d-1組及50.0、100.0μg.kg-1.d-1組)AR灰度值低于正常組和對(duì)照組,且隨著DES劑量的增加其表達(dá)水平逐漸降低,其降低幅度有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);
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10、ES影響下,相同發(fā)育階段的睪丸、睪丸引帶、脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞3個(gè)部位的AR表達(dá)變化情況正性相關(guān),具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1. DES可致小鼠睪丸、睪丸引帶發(fā)育不良、形態(tài)異常、組織結(jié)構(gòu)紊亂,且與劑量關(guān)系密切;高劑量DES可致脊髓前角GFN神經(jīng)細(xì)胞稀疏,體積增大,提示環(huán)境雌激素能夠影響睪丸、睪丸引帶以及脊髓GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)育,對(duì)“睪丸-GFN-睪丸引帶”軸有形態(tài)學(xué)上的不良影響。
　　2. AR表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞

11、、睪丸引帶中央的間充質(zhì)細(xì)胞及脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞,與正常組及對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組AR表達(dá)均明顯受抑制,且隨著劑量的增加抑制作用越明顯,有劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　3.隨著小鼠天齡的增加,睪丸中 AR表達(dá)逐漸增加,睪丸引帶中 AR則呈現(xiàn)出先增加后逐漸減少的趨勢(shì),脊髓前角GFN運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞AR表達(dá)逐漸下降。結(jié)合睪丸以及睪丸引帶、脊髓前角的形態(tài)學(xué)變化,表明“睪丸-GFN-睪丸引帶”在生殖系統(tǒng)正常發(fā)育過程中關(guān)系密切,確是調(diào)節(jié)睪丸下降的一條完