干血點采樣技術和干血漿采樣技術在麥考酚酸代動力學測定中的應用.pdf

1、將全血樣品收集在卡紙上，即干血點采樣(DBS)；將血漿樣品收集在卡之上，即干血漿采樣(DPS)。國外文獻報道：這兩種方法在血樣采集方面比傳統(tǒng)方法有一定的優(yōu)勢：需求較少的血量，可減少動物使用，方便血樣采集、存儲運輸，簡化樣品前處理。到目前為止，DBS法與LC-MS/MS技術聯用在藥物小分子定量分析中已成為一個重要的方法，將在藥代動力學研究中得到越來越多的應用。但DBS、DPS方法學并不是十分成熟，對于DBS、DPS法和蛋白沉淀法綜合對比并

2、結合臨床藥代動力學數據分析的研究極少。
　　 麥考酚酸(MPA)是一種免疫抑制劑，常用于預防同種腎移植病人的排斥反應及治療難治性排斥反應，降低自身免疫。
　　 本論文研究的目的是：通過在DBS和DPS實驗過程中對比不同的樣品處理方法，完成并總結影響DBS和DPS方法學的因素，盡可能成熟DBS和DPS方法學實驗設計，能為以后的BDS和DPS方法學設計提供較為可靠的數據支持。分別用DBS、DPS法和蛋白沉淀法處理MPA臨床實

3、驗的血樣后，分析其藥代動力學數據，總結DBS和DPS法實際應用意義。比較DBS、DPS法和蛋白沉淀法，總結其優(yōu)勢與不足。
　　 建立MPA的LC-MS/MS檢測方法。以吡咯列酮作為內標，用配有ESI離子源及Xcaliber1.2數據處理系統(tǒng)的TSQHPLC-MS/MS分析，色譜柱采用EcosilC18柱，柱溫為30℃，流動相為乙腈：甲醇：0.01mol·L-1甲酸水(0.1％甲酸)=45:30:25，流速為0.4mL·min-1

4、，MPA和比格列酮的保留時間分別為6.81min和7.33min，儀器運行時間為8.6min(2min之前和8.4min之后切換)。質譜檢測采用正離子MRM方式檢測，毛細管溫度為280℃，鞘氣壓力為40psi，輔助氣壓力為10psi，碰撞能26ev，選擇離子為MPAm/z338.2[M+NH4]+→m/z207.2，吡咯列酮m/z357.1[M+NH4]+→m/z134.1。
　　 對于一些可能影響DBS和DPS方法的一些因素如

5、：點卡體積、打孔位置、提取液的比例和提取方法等都做了分析比較。結果顯示：1.0μg·mL-1濃度的MPA10μL、15μL和20μL不同的點卡所測得的結果基本相同(P>0.05)，點卡體積對結果沒有顯著的影響，選擇20μL為點卡體積；邊緣打孔的響應值比中心打孔的要高10％左右，但其精密度要差4％左右(邊緣打孔精密度為9％，中心打孔精密度為5％)，選擇中心打孔；單變量對比不同提取液分別為甲醇：水=25:75、甲醇：水=50:50、甲醇：水

6、=75:25提取后所得結果，所測得結果相近，精密度相似，甲醇：水=25:75回收率雖略高但提取液呈紅色，過固相萃取柱也不能濾去，同時對比了加入適量甲酸(含量為0.1％)和不含甲酸的提取液，結果為不加甲酸的提取率略高，所以提取液選為不含甲酸的甲醇：水=50:50；對比不同提取方法，超聲10min和30min、渦旋提取10min和30min所測得平均濃度相近，精密度相似，基于簡化實驗，最后選擇超聲10min為提取方法。
　　 蛋白沉

7、淀法，MPA在0.05～50μg·mL-1的范圍內呈良好線性關系(r2=0.999)。批內和批間精密度RSD均小于5％，準確度分別在99.0～104.0％之間，最低定量限為0.05μg·mL-1，提取回收率在97.6～100％之間，基質效應在0.97～1.00之間，證明所建立方法靈敏、可靠、專屬性強，可以滿足藥代動力學研究要求。
　　 DBS方法學，MPA在0.05～50μg·mL-1的范圍內呈良好線性關系(r2=0.998)。

8、批內和批間精密度RSD均小于7％，準確度分別在96.0～113.0％之間，最低定量限為0.05μg·mL-1，提取回收率在58.8～61.2％之間，基質效應在1.02～1.06之間，證明所建立方法靈敏、可靠、專屬性強，可以滿足藥代動力學研究要求。
　　 DPS方法學，MPA在0.05～50μg·mL-1的范圍內呈良好線性關系(r2=0.998)。批內和批間精密度RSD均小于8％，準確度分別在94.0～105.096之間，最低定量

9、限為0.05μg·mL-1，提取回收率在55.3～64.9％之間，基質效應在0.85～1.04之間，證明所建立方法靈敏、可靠、專屬性強，可以滿足藥代動力學研究要求。
　　 FTA卡很適合DBS和DPS方法學的確定。
　　 根據臨床藥代動力學實驗數據得出結論，DPS方法和蛋白沉淀法所得實驗數據基本相同，但DBS法與DPS法和蛋白沉淀法有較大的差距，可能因為DBS法用全血點卡，由于血漿蛋白結合率的個體差異導致所測得的實驗數據