HuR介導(dǎo)IL-1β增加NSCLC細(xì)胞VEGF-C mRNA穩(wěn)定性的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景： 腫瘤擴(kuò)散的重要機(jī)制之一是腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位，通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。近年研究證實(shí)，腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管生成促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后差、生存率低。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-c和-D是最重要的兩個(gè)淋巴管生成因子，它們通過結(jié)合淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-3，繼而促進(jìn)LEC增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，從而誘導(dǎo)淋巴管生成。 大量臨床病理研究證實(shí)，在多種

2、人類腫瘤中，如非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體腫瘤，VEGF-C表達(dá)與微淋巴管密度(LMVD)、淋巴管侵襲(LVI)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。多種化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤模型、轉(zhuǎn)基因模型和移植瘤模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF-C過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤淋巴管生成、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，深入探討VEGF-C表達(dá)調(diào)控，以抑制VEGF-C表達(dá)，阻斷淋巴管生成，最終改善惡性腫瘤患者的預(yù)后，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景。與VEGF-A相似，多種炎

3、癥信號(hào)和分子如低氧、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、促炎細(xì)胞因子白介素1-β(I1-β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等通過自分泌和旁分泌的機(jī)制上調(diào)VEGF-CmRNA和蛋白在不同類型細(xì)胞中的表達(dá)。然而，既往的研究多局限于核因子-κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄水平對(duì)VEGF-C的調(diào)控，對(duì)其在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控尤其是在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控和機(jī)制尚不清楚。 人抗原R(HuR)是胚胎致死視覺異常(ELAV)家族的RNA結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)HuR與神經(jīng)

4、分化有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)HuR是調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的重要RNA結(jié)合蛋白。研究證實(shí)，在細(xì)胞外信號(hào)的作用如炎癥因子、激素和生長(zhǎng)因子等刺激下，HuR可在細(xì)胞核和細(xì)胞漿之間穿梭，導(dǎo)致胞漿中的HuR蛋白量增高，并通過RNA識(shí)別基序(RRM)與多種mRNA3’端未翻譯區(qū)(3’UTR)的富含AU堿基的序列(ARE)結(jié)合，使mRNA從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿的過程中保護(hù)mRNA免受核酸酶降解，從而增加mRNA的穩(wěn)定性。多種分子的mRNA，如介導(dǎo)細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期蛋

5、白cyclinA、cyclinB，細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8，以及VEGF-A和COX-2的mRNA含有ARE，均受ARE結(jié)合蛋白調(diào)控(AUBP)，包括增加mRNA穩(wěn)定性的HuR和促進(jìn)mRNA降解的AU結(jié)合因子-1(AUF-1)。但HuR是否也調(diào)控了VEGF-C表達(dá)，目前尚不清楚。 體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，HuR不僅在多種人類腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，而且證實(shí)胞漿HuR陽(yáng)性而不是胞核HuR陽(yáng)性與乳腺癌和直腸癌等預(yù)后相關(guān)。但目前

6、尚未見HuR與肺癌關(guān)系的報(bào)告。最近研究發(fā)現(xiàn)，胞漿HuR陽(yáng)性并與乳腺癌ER陰性、PR陰性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些研究提示HuR可能參與了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，但具體機(jī)制尚不清楚。 目的： 研究HuR與VEGF-C表達(dá)在肺癌中的關(guān)系，并進(jìn)一步探討HuR調(diào)控VEGF-CmRNA穩(wěn)定性的分子機(jī)制，為尋找新的抗腫瘤淋巴管生成分子靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HuR和VEGF-C蛋白在81例NSCLC

7、組織和15例肺良性病變組織中的表達(dá)，并分析腫瘤胞漿、胞核HuR表達(dá)分別與VEGF-C表達(dá)、腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。 2.以Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞為主要體外模型，應(yīng)用Westernblotting、定量RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)IL-1β刺激LLC細(xì)胞表達(dá)VEGF-C蛋白和mRNA的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。 3.利用放線菌素D(ActD)脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)觀察IL-1β上調(diào)VEGF-C表達(dá)是否與其mRNA

8、穩(wěn)定性增加有關(guān)。 4.構(gòu)建HuR干擾載體pGenesil-siHuR，通過siRNA干擾HuR表達(dá)，以明確HuR在IL-1β增加LLC細(xì)胞VEGF-CmRNA穩(wěn)定性中的作用。 5.構(gòu)建HuR真核表達(dá)載體，體外分析高HuR水平對(duì)IL-1β刺激LLC細(xì)胞表達(dá)VEGF-C的影響。 6.MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別分析HuR過表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)LLC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響。 7.用C57BL/6小鼠，建

9、立高表達(dá)HuR和非高表達(dá)HuR的LLC皮下移植瘤模型；分析高HuR水平對(duì)移植瘤生長(zhǎng)、VEGF-C表達(dá)、淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的影響。 8.Westernblotting和定量RT-PCR分別檢測(cè)高表達(dá)HuR的LLC移植瘤、對(duì)照組移植瘤VEGF-C蛋白和mRNA的表達(dá)情況。 9.利用免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀察IL-1β刺激肺腺癌細(xì)胞后HuR蛋白在胞核-胞漿的轉(zhuǎn)運(yùn)，并進(jìn)一步分析p38MAPK通路在調(diào)控HuR轉(zhuǎn)運(yùn)中的作

10、用。 10.構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，通過雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、RT-PCR分析含有ARE的VEGF-C3’UTR在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性中的作用，并進(jìn)一步分析不同ARE區(qū)域調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的差異。 結(jié)果: 1.81例NSCLC的HuR胞漿陽(yáng)性表達(dá)率、HuR胞核陽(yáng)性表達(dá)率、VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)率分別為45.7％(37/81)、82.7％(67/81)和70.4％(57/81)，與肺良性病變組織比較均有顯著性差異

11、(P＜0.01)。VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)和NSCLC臨床分期密切相關(guān)(P＜0.01)，但與患者性別、年齡、組織學(xué)類型和組織分化程度均不相關(guān)(P＞0.05)。胞漿HuR表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)、分化程度(P＜0.05)和pTNM分期密切相關(guān)(P＜0.05)，但與患者的性別、年齡和肺癌組織學(xué)類型無明顯關(guān)系(P＞0.05)。胞漿HuR高表達(dá)(P＜0.05)而不是胞核HuR高表達(dá)(P＞0.05)與VEGF-C的

12、表達(dá)呈正相關(guān)。 2.隨著IL-1β濃度(0-20mg/ml)增加，LLC細(xì)胞胞漿VEGF-C蛋白和mRNA以及分泌的VEGF-C水平顯著上調(diào)，刺激后12h達(dá)最高值。 3.IL-1β誘導(dǎo)VEGF-C表達(dá)與VEGF-CmRNA穩(wěn)定性增加密切相關(guān)。 4.成功構(gòu)建了pGenesil-siHuR干擾載體；載體轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞下調(diào)了HuR表達(dá)，繼而阻斷了IL-1β誘導(dǎo)的VEGF-C表達(dá)并降低了VEGF-CmRNA穩(wěn)定性。

13、 5.成功構(gòu)建了HuR真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HuR；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞增加了IL-1β誘導(dǎo)的VEGF-C表達(dá)。 6.Transwell和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HuR過表達(dá)增加了LLC細(xì)胞遷移，促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)。 7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為pEGFP-N1/LLC組和pEGFP-HuR/LLC組。小鼠皮下移植LLC后30d，比較pEGFP-N1對(duì)照組(n=6)同側(cè)頸上、對(duì)側(cè)頸上及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為分別為100％、83.3％和33.3

14、％，而pEGFP-HuR組分別為100％、66.7％和100％。同側(cè)頸上和對(duì)側(cè)頸上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但pEGFP-HuR組腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，分別為100％和33.3％。兩組雙肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)分別為(6.5±2.1)和(10.7±2.4)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HuR過表達(dá)組移植瘤LMVD為19.7±2.4，顯著高于對(duì)照組(13.2±2.8)(P＜0.05)。 8.

15、Westernblotting和定量RT-PCR結(jié)果顯示HuR過表達(dá)的LLC移植瘤VEGF-C蛋白和mRNA水平顯著高于對(duì)照組。 9.免疫熒光和共聚焦顯微鏡及Westernblotting結(jié)果顯示，IL-1β增加了HuR蛋白在胞漿中的聚集。 10.p38MAPK特異性抑制劑SB352038阻斷了IL-1β誘導(dǎo)的HuR胞核-胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)和VEGF-C表達(dá)，并降低了VEGF-CmRNA的穩(wěn)定性和VEGF-C表達(dá)。 11.

16、成功構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告載體pGL3-VEGF-C3’UTR、pGL3-VEGF-C3’UTR1、pGL3-VEGF-C3’UTR2和對(duì)照載體pGL3-VEGF-CCR。 12.定量RT-PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，與pGL3-VEGF-CCR轉(zhuǎn)染組比較，pGL3-VEGF-C3’UTR轉(zhuǎn)染組熒光素酶mRNA水平和熒光素酶活性顯著降低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)pGL3-VEGF-C3’UTR2轉(zhuǎn)染組熒光素酶mRNA水平和熒光素酶活性