表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型人工晶狀體研制及其抑制后發(fā)性白內(nèi)障的研究.pdf

1、第一部分：表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型人工晶狀體研制及其理化性質(zhì)和分子生物學指標檢測
　　 目的：
　　 評價應用靜電層層自組裝技術在疏水性丙烯酸酯人工晶狀體(IOL)表面構建TGF-β2抗體多層膜的可行性，并檢測表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL的理化性質(zhì)和分子生物學指標。
　　 方法：
　　 首先應用大氣壓下輝光放電等離子體預處理疏水性丙烯酸酯IOL，使其表面帶上足量負電荷。然后應

2、用靜電層層自組裝技術在IOL表面逐層沉積聚乙烯亞胺(PEI)、TGF-β2抗體(anti-TGF-β2)和聚賴氨酸(PLL)，從而在IOL表面構建PEI-(anti-TGF-β2/PLL)4-(anti-TGF-β2)多層膜。以石英晶體微天平(QCM)模擬并實時監(jiān)測靜電層層自組裝過程，了解自組裝膜的增長方式，自組裝膜中每層沉積的TGF-β2抗體的平均質(zhì)量、厚度和密度，以及自組裝膜中TGF-β2抗體的免疫活性。以靜態(tài)水接觸角(WCA)檢測

3、新型IOL的親水性。以X-射線光電子能譜分析(XPS)檢測新型IOL表面化學元素組成變化。以場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察新型IOL的表面形態(tài)變化。應用SFDA關于IOL質(zhì)量檢測國家標準(YY-0290)對新型IOL進行光焦度、像質(zhì)、光譜透過率和動態(tài)疲勞耐久性測試，以觀察新型IOL的光學和力學特性有無改變。應用免疫熒光和激光掃描共焦顯微鏡觀察新型IOL表面自組裝膜的穩(wěn)定性，以及自組裝膜中TGF-β2抗體的

4、免疫活性。
　　 結果：
　　 應用QCM模擬靜電層層自組裝過程，發(fā)現(xiàn)PEI、TGF-β2抗體和PLL可以線性增長的方式逐層沉積在IOL表面，自組裝膜中每層沉積的TGF-β2抗體的平均質(zhì)量、厚度和密度分別為(77.45±8.00)ng，(1.42±0.15)nm和(0.48±0.05)μg/cm2。QCM檢查同時發(fā)現(xiàn)自組裝膜中的TGF-β2抗體可以0.82:1的比例結合人重組TGF-β2因子，提示自組裝膜中TGF-β2抗

5、體保持良好的免疫活性，而且主要以側(cè)面向上的方式分布。新型IOL的WCA為73.2°，較未處理IOL的WCA為92.1°明顯降低，提示新型IOL的親水性明顯改善。XPS檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL表面化學成分中氧和氮元素含量明顯升高，進一步證實TGF-β2抗體成功自組裝到IOL表面。AFM檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL的表面粗糙度較未處理組IOL稍有增加，F(xiàn)ESEM檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL表面形態(tài)光滑、平整，與未處理組IOL無差別。新型IOL的光焦度、像質(zhì)、光譜透過

6、率和動態(tài)疲勞耐久性測試均符合國家標準。免疫熒光和激光掃描共焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)TGF-β2抗體多層膜可在新型IOL表面持續(xù)穩(wěn)定存在至少3個月，自組裝膜中TGF-β2抗體可以與外加TGF-β2因子結合，形成均勻、密集分布的免疫熒光沉積顆粒，提示自組裝膜中TGF-β2抗體保持良好的免疫活性。
　　 結論：
　　 本研究應用大氣壓下輝光放電等離子體和靜電層層自組裝技術首次在IOL表面成功構建了TGF-β2抗體多層膜，TGF-β2抗

7、體多層膜可以在IOL表面長期穩(wěn)定存在，并保持良好的抗體免疫活性，而且對IOL表面形態(tài)、光學和力學特性無明顯影響。
　　 第二部分：表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型人工晶狀體抑制后發(fā)性白內(nèi)障的研究
　　 目的：
　　 評價表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL在體外和活體兔眼內(nèi)預防后發(fā)性白內(nèi)障的有效性和安全性。
　　 方法：
　　 將人晶狀體上皮細胞(LECs)接種到表面自組裝TGF-β

8、2抗體多層膜的新型IOL和未處理IOL的后表面，LECs接種后6h、24h和48h，分別應用倒置相差顯微鏡觀察LECs在實驗組和對照組IOL表面的粘附和增殖情況。應用劃痕實驗觀察并比較新型IOL和未處理IOL表面LECs在10ng/mlTGF-β2因子作用下的遷移情況。以α-SMA作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化標記蛋白，應用免疫熒光顯微鏡觀察新型IOL和未處理IOL表面LECs在10ng/mlTGF-β2因子作用下的轉(zhuǎn)分化情況。在活體兔眼內(nèi)行晶狀

9、體超聲乳化吸除并植入新型IOL(實驗組)或未處理IOL(對照組)，制備兔眼后發(fā)性白內(nèi)障模型，在術后1d、3d、1w、1mon、3mon，應用裂隙燈顯微鏡觀察實驗組和對照組兔眼前房閃輝、前方細胞和虹膜后粘連程度等前房炎癥反應情況，并按照相應評價標準進行評分；術后1mon和3mon應用裂隙燈后照法拍攝后囊膜照片，以自行設計的PCO評價軟件測量并比較實驗組和對照組兔眼的后囊膜渾濁(PCO)嚴重程度。術后3mon處死兔，以Miyake-Appl

10、e后照法拍照進行PCO評分。摘取兔術眼眼球，取出IOL，應用免疫熒光聯(lián)合激光掃描共焦顯微鏡檢查了解新型IOL表面TGF-β2抗體多層膜的完整性。將晶狀體囊膜以石蠟包埋切片后行HE染色，觀察囊膜表面LEcs增殖和細胞外基質(zhì)沉積情況；同時應用免疫組織化學法觀察α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ在囊膜表面的表達情況。
　　 結果：
　　 表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL可以短暫(細胞接種后6h內(nèi))抑

11、制LECs的粘附，但最終對LECs的粘附和增殖無明顯影響。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)LECs在新型IOL表面的遷移能力較在未處理IOL表面明顯下降。免疫熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)新型IOL表面LECs可以保持上皮細胞形態(tài)，而且α-SMA表達很少；而未處理IOL表面LECs呈纖維細胞形態(tài)，而且大量表達α-SMA。直接免疫熒光聯(lián)合激光掃描共焦顯微鏡檢查顯示，IOL表面的TGF-β2抗體多層膜在活體兔眼內(nèi)可以較長時間穩(wěn)定存在。兔眼后發(fā)性白內(nèi)障模型研究發(fā)現(xiàn)，除術后1

12、w和1mon時實驗組的前房閃輝和前房細胞較對照組有所減輕外，兩組之間的術后前房炎癥反應無明顯差別。裂隙燈后照法與Miyake-Apple后照法PCO評分均顯示對照組后囊膜PCO評分顯著高于實驗組。HE染色顯示實驗組囊膜較薄，表面LECs數(shù)量較對照組明顯為少。免疫組織化學檢查發(fā)現(xiàn)實驗組囊膜表面α-SMA和CollagenⅠ表達量較對照組明顯為少。
　　 結論：
　　 表面自組裝TGF-β2抗體多層膜的新型IOL可以顯著抑制